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        抗 体 夹 心 ELISA 法检测可溶性抗原

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        抗 体 夹 心 ELISA 法检测可溶性抗原

        该检测方法比抗原直接结合到固相上的 ELISA 方法敏感性高 2〜5 倍(图 I.1. 3)。
        图 1 . 1 . 3 抗 体 夹 心 ELISA法 检测 可 溶 性 抗 原 。 A b ,抗 体 ; A g ,抗 原 ; E ,酶 。

        附 加 材 料(其他材料见基本方案)

        特 异 性 抗 体(单 克 隆 或 多 克 隆 )或 者 来 自 抗 血 清 、腹 水 或 杂 交 瘤 上 清 液(单元1 . 4 ) 中 的 免疫球蛋白(单 元 1.5,单 元 1.7)。

        1.用 PBSN 稀释特异性抗体或免疫球蛋白,配 制 包 被 抗 体 溶 液(最 终 浓 度 0.2〜10 ug/ml)

        2.采用十字交叉连续稀释分析法,确定待检测抗原浓度所需的包被抗体和酶-抗体结合物 的 浓 度(见辅助方案),用 PBSN 配制此浓度的包被抗体溶液。

        3.用 50 ul 包被抗体溶液包被 Immulon 滴定板,并 封 闭(见基本方案,步 骤 3〜5)。

        4.用封闭缓冲液按 1 : 3 (v/ V ) 连 续 稀 释(见辅助方案) 同源抗原,配制标准抗原的系列稀释溶液。使 用 结 合 动 态 范 围 大(1 5 % 〜8 5 % ,总 范 围 是 0.1〜IOOOng 抗原/ml) 的稀释液。

        虽然标准曲线对于精确测定待测样品中抗原量是必要的,但不需要用于定性
        检测。

        5.用封闭缓冲液配制待测抗原溶液的系列稀释度(通 常 是 1〜IOOng 抗原/ml)。如需要 ,测定待测抗原溶液 1〜2 个系列稀释度,确保至少一个稀释度可以精确测定。

        6.抗 体 包 被 孔 中 加 入 待 测 抗 原 溶 液 或 标 准 抗 原 稀 释 液(步 骤 4),室 温 下 孵 育 2 h以上。做 2 或 3 个复孔确保可精确定性测量,快速加入样品以最大限度减少因孵育时间不同造成的误差。

        7.洗 涤 滴 定 板(见基本方案,步 骤 7),加 入 50ul 碱性磷酸酶标记的特异性抗体(通常是 25〜400ng 特异抗体/ml),室温下孵育 2 h。

        8.洗涤滴定板,每孔中加人 75ul MUP 或 NPP 底物溶液,室温下孵育 lh ,用微量滴定板检测仪检测。如显色反应水平低,应在显色后数小时重新检测滴定板。

        9.绘制基于标准抗原溶液连续稀释数据的标准曲线。抗原浓度对数值为轴 ,荧光度或吸光度为y轴 。用内插法,在标准曲线中求出待测溶液中抗原浓度。

        来源:丁香实验

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