干细胞与肝组织工程

 

骨 髓 造 血 干 细 胞

骨 髓 间 充 质 干 细 胞

人 胎 肝 干 细 胞

1 ) 人胎肝干细胞的分离、培养和鉴定 (图 9.4)(Tatenoc et al. 2002)

⑴ 水 囊 引 产 中 期 (6 月龄) 妊娠胎儿 (孕妇身体健康，肝功能正常，胎儿处置获得其父母的知情同意)

诱 导 分 化 的 肝 脏 细 胞 的 鉴 定

1 ) 免疫荧光法染色检测

取不同代数 M S C 诱 导 后 2 0 天的细胞爬片，进 行 C K 18、 A F P 、白蛋白等肝脏细胞标志物/特异蛋白的免疫组化鉴定，第 二 抗 为 F I T C 或 T R I C E 标 记 的 IgG, 阴性对照用O. OlmmolTL 的 P B S 代替一抗，实验对照用未诱导的 M S C 细胞爬片直接进行免疫组织化
学染色。参照中山生物技术公司提供的免疫组化染色方法，操作步骤如下。

⑴ 细 胞 爬 片 用 P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

⑵ 4 % 的多聚甲醛室温固定 I5 min， P B S 洗 涤 3 次 ，每 次 5 min。

(3) 用 0.1% Triton 似增加细胞膜的通透性) 和 3 % 过氧化氢 (以消除内源性过氧化物酶的活性) 孵育 lOmin。

⑷ 蒸 馏 水 冲 洗 ， P B S 浸 泡 5 min。

(5) 加 2 〇% 马血清 (1 :20) 以封闭非特异性结合位点， 37T 孵 育 15 min。

(6) 巧去血清 (不洗涤)，分另 Ij 加 TnI 和 desmin 抗体工作液 5 〇叱置于湿盒中于 37 ℃孵 育 30ml放 代 过 夜 ；阴性对照用〇.01m m o y L 的 P B S 代替一抗，实验对照用未诱导的 M S C 细胞爬片直接进行免疫组织化学染色。

(7) PBS 冲洗， 5 minx3 次
。
(8) 滴加荧光标记的二抗 (兔抗山羊 IgG-F I T C 和抗小鼠 IgG-TRITC) 工作 液 37℃孵育30 min

(9) P B S 冲 洗 3 次 ，直接在荧光显微镜下观察实验结果并拍照。

2 ) 电镜观察

⑴ 细 胞 用 培 养 基 洗 涤 3 次后，用细胞刮刮去细胞，抽吸细胞悬液，置入玻璃离心管 ， 800r/min 离心 8 min。

⑵ 前 固 定 ： 3 % 戊二醛 (l/15mol/L P B S p H 7.4)，代 下 固 定 2 h 。

⑶ 漂 洗 ：代 条 件 下 ， l/15mol/L P B S +0.19mol/L 蔗糖缓冲液反复漂洗。