方案8 酵母提取物的制备实验

由于酵母的经典遗传分析和分子遗传分析都已经研究得非常透彻，因而对于纯化重组动物蛋白来说，酵母是一个很有吸引力的表达体系。关于培养和收集酵母细胞的讨论，尤其是芽殖酵母，参见 Jazwinski(1990)。酵母细胞的裂解方法有很多种，包括自溶、压力破碎（如 French 加压罐）、研磨（玻璃珠振荡）和酶裂解（如 Zymolase) 等。本方案讨论的振荡玻璃珠研磨，是最简便的方法之一。这对于小体积（如 <1ml, 使用微量离心管）和数升的体积（使用特制的DynoMill仪器）都是很有效的。经相差显微镜检测，细胞破碎率一般>95%。

1.在微型离心机上离心 3 mm，以收集细胞。

2.去上清，用 PBS 重悬细胞，再离心 3 min。

3.去上清，估算细胞沉淀的体积，向细胞沉淀中加人 3 倍体积的冰浴裂解缓冲液，悬浮后置于冰上。

4.加入等体积的预冷玻璃珠。

5.剧烈振荡悬浮液 30s。

6.重复步骤5，并在相差显微镜下观察，直到大部分酵母细胞被裂解。

7.4°C 条件下在小型离心机中离心悬浮液 5 min，

8.小心地倒出上清，并转移到另一管中，置于冰上备用。