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        mRNA 的细胞内注射实验

        相关实验:mRNA 的细胞内注射实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、用于细胞内注射的加帽 mRNA 的制备

        材料

        —T3 或 T 7 RNA 聚 合 酶 ( Promega) —线性DNA 一5 X Cap-Scribe缓 冲 液 ( Boehringer Mannheim)。缓冲液内核糖核昔_二鱗酸和加 帽-核苷酸( P1J '- (7-甲基) -鸟 苷 P3 5'鸟苷三磷酸)的浓度经过优化,以确保高效合 成加帽mRNA HRNaid-试 剂 盒 (Bio 101) 〜RNA酶 抑 制 剂 ( Promega; 40 U/fxl) 〜脱氧核糖核酸酶I (Gibco-BRL; IU/V1)

        步骤

        1.依次加入下列物质,终体积为 20ul,冰上操作:
        mRNA 的细胞内注射实验

        2.37℃ 温育 lh。

        3.加入 Iul DNA 酶 I(无 RNA 酶),37℃ 温育 10 min。

        4.用 RNaid 试剂盒提纯 mRNA。

        5.25ul 灭菌水(无 RNA 酶)溶解 RNA。

        二、注射的准备

        材料

        mRNA 的细胞内注射实验
        mRNA 的细胞内注射实验

        溶液

        (未提到的溶液,可以参见方法 1「培养神经元的原位杂交」相关部分)

        mRNA 的细胞内注射实验

        步骤

        1.从中枢神经系统分离神经元,保持其一长段轴突的完整。

        2.在条件培养基中培养 i8~48 h, 直到从原有的轴突长出足够的突起。

        3.用锋利的玻璃电极,从距离胞体大约一个细胞直径的部位横切轴突。

        4.用微量加样器给玻璃电极充灌 mRNA(质量浓度 2 〇?50ng/pd)。仅使电极头部充满 mRNA 溶液(每个电极大约用 0.3ul)。

        5.穿刺轴突,以 20psi、持续 1~15S 脉冲将 mRNA 注射入轴突。在相差显微镜下可观察到白色小滴状的 mRNA。

        6.温育。温育时间根据细胞类型和所用 mRNA 种类而定。在我们的实验中,应用椎实螺属编码卵生激素前体的 mRNA,—般注射后温育 2 h 可以检测到其转化的蛋白。

        7.固定并透膜处理细胞,按培养神经元:ISH 方法中第 1-3 步进行。

        8.TBSGT 洗涤 2 次,每次 5 min。

        9.与一抗温育、室温 2 h 或 4℃ 过夜。

        10.TBSGT 洗涤 2 次,每次 10 min。

        11.与二抗温育,室温 1~2 h。我们的实验应用 FITC 交联的二抗,也可用酶交联抗体。用碱性磷酸酶交联二抗的步骤可参见方法 i「培养神经元的原位杂交’

        12.TBSGT 缓冲液洗涤丄次,5 min.

        13.水洗涤 2 次,每次 I0 min。

        14.75% 甘油(溶于水)封片,甘油溶液中含 0.5% 乙二胺,以减慢 FITC 的褪色。

        15.倒置荧光显微镜观察。

        三、结果

        为研究离体轴突中的 mRNA 是否能转化成蛋白质,我们将编码卵生激素(ELH) 前体的 mRNA 注入 PedalA 细胞的轴突。我们首先证实这些细胞不表达 ELH 基因。然后通过免疫细胞化学方法用 ELH 的抗血清检测注射 mRNA 的翻译。结果显示,离体轴突能够将注射的 mRNA 转化成通过免疫细胞化学方法可检测到的蛋白质。转化产物主要定位于生长锥和曲张体(图 3-7)。
        mRNA 的细胞内注射实验

        来源:丁香实验

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