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        基因表达的系列分析实验

        相关实验:基因表达的系列分析实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、一般原则

        若用于 SAGE 的 RNA 有足够的量,最好用 2.5~5 ug polyA+RNA, 可按实验方案 A 进行。这里我们还提供了实验方案 B,它在多个步骤上已做了修改,适用于仅有微量的原材料(例如,利用这个流程我们能从来自于 300fxm 脑切片的海马样品中获得基因表达谱)。后一实验方案尤适用研究神经组织表达,由于其复杂的神经环路及高度特化的结构,获得大量均质组织以分离 RNA 往往是不可能的。

        下面对两组实验方案第 1 步到第 8 步进行了详细的描述,从第 9 步起两组方案步骤相同。

        二、mRNA 的分离

        实验方案 A

        许多试剂盒分离 PdyA+RNA 的效果都很好,我们推荐使用 mRNADIRECT 试剂盒(Dynal;610.11) 来从组织中或培养的细胞中分离 polyA+RNA,或者用 mRNA 纯化试剂盒(Dynal;610.01) 从总 RNA 中分离 pdyA+RNA。在试剂盒说明书中对所有步骤有详细的描述。

        实验方案 B

        1.TRIzol 分离总 RNA(见 DD 实验方案)。

        2.在 RNA 沉淀后,将 1~10 吨总 RNA 重悬于 20 ul 裂解缓冲液中(mRNA 捕获试剂盒)。

        注意:我们用更少量的总 RNA 也可成功地提取 mRNA,但这要求在 SAGE 后面的步骤中进行一些修改。

        3.稀释 20X 生物素化的 oligo(dT)20 引物(mRNA 捕获试剂盒)到最终浓度为 5Pmol/ul。

        4.将 4 ul 稀释的引物加入到含有 RNA 的裂解缓冲液中。

        5.在 37℃ 退火 5 min。

        6.转移 RNA 到一个链霉抗生物素包被的 PCR 管中(mRNA 捕获试剂盒)。

        7.在 37℃ 保温孵育 3 min(在此步中通过链球菌素-生物素结合 mRNA 被固定于试管壁上)。

        8.移去管中溶液(含有未结合的 RNA 片段:rRNA、tRNA 等),用 50 ul 洗液小心地冲洗试管 3 次(mRNA 捕获试剂盒)。

        9.去除洗液。

        10.立即进行 cDNA 合成步骤。

        三、cDNA 合成

        实验方案 A

        1.以 oligo(dT)-引物加入 2.5~5 ug polyA+RNA 合成 cDNA。

        2.在 0.5 mlPCR 管中混合(冰上操作):

        —2.5 ul polyA+RNA(1 ug/ul)

        一 4 ul 5X 第一^缓冲液

        —2 ul 0.lmol/LDTT

        —1 ul 10 mmol/LdNTPs

        一 1 ul oligo(dT)18(生物素化的)(0.5ug/ul)

        一 1 ul SuperScriptHRT(200ug/ul)

        —8.5 ul DEPC 水

        总体积为 20 ul。

        3.42℃ 孵育 2 h(可在 PCR 仪中进行)。

        4.在冰上加单链 cDNA 进行第二链合成:

        —(20 ul 单链 cDNA)

        一 16 ul 5x 第二链缓冲液

        —1.6 ul 10 mmol/LdNTPs

        —2 ul DNA 多聚酶 I(10u/ul)

        —1 ul T4DNA 连接酶(5u/ul)

        —1 ul RNase H(5u/ul)

        一 38.4 ul 重蒸(馏)水

        总体积为 80 ul。

        5.在 16℃ 孵育 2 h。

        6.用 LoTE 扩容至 200ul。

        7.加等体积的酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)(PCI)。

        8.振荡。

        9.在 4°C 微量离心机中以 13OOOr/min 离心 5 min。

        10.转移上层水相至一新 1.5 ml Eppendorf 试管中。

        11.乙醇沉淀:

        —3 ul 糖原

        一 100 ul 10 mmol/L 乙酸铵

        一 700 ul 乙醇

        12.置于-20°C 下 30 min。

        13.在 4”C,在微量离心机中以 13OOOr/min 离心 15 min。

        14.以 500 ul 70% 乙醇有力振荡冲洗沉淀两遍。

        15.去除 70% 乙醇,让沉淀物在空气中风干约 15 min。

        16.将沉淀重新悬浮于 20 ul LoTE 中。

        实验方案 B

        注意:用来捕获 PolyA+RNA 并将其固定到试管壁上(实验方案 B,第 1 步)的 oligo(dT)2a 引物(生物素化,mRNA 捕获试剂盒),可直接作为 cDNA 合成的引物,cDNA 合成后持续结合于试管壁上,直到第六步通过 TE 消化释放。

        1.用 50 ul 1 第一链缓冲液冲洗捕获 PolyA+RNA 的试管,然后移去缓冲液。

        2.用下述步骤代替 IX 第一链缓冲液(在冰上移液):

        —4 ul 的 5X 第一链缓冲液

        一 2 ul 的 0.1mol/L TT

        一 I ul 的 10 mmol/LdNTPs

        一 1 ul 的 SuperScriptII RT (200 U/ul)

        —12 ul DEPC 水

        总体积为 20ul。

        3.42℃ 下孵育 2 h(在 PCR 仪进行)。

        4.从试管中移去反应混合物,并以 50 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次 (mRNA 捕获试剂盒)。

        5.移去冲洗液,用 5 〇 4 的 IX 第二链缓冲液洗涤试管 1 次。

        6.用下述溶液替代 IX 第一链缓冲液

        一 4 ul5X 第二链缓冲液

        _0.4ul 的 IOmmol/LdNTPs

        —Iul DNA 多聚酶 I (10 U/pl)

        —0.5ulT4DNA 连接酶(5U/-)

        —0.5ul RNaseH(5U//^l)

        —13.6 ul 蒸馏水

        总体积为 20ul。

        7.在 16℃ 下孵育 2 h。

        双链 cDNA 可保存于-20℃, 或者直接在下一步中应用(以锚定酶消化 cDNA)。

        来源:丁香实验

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