从豚鼠小肠黏膜中分离微过氧化物酶体

1. 处死麻醉后的豚鼠，取出全部的小肠（从胃到盲肠），用一只大的（50 ml）皮下注射器灌注冷的匀浆缓冲液来清洗其中的内容物。

2. 将小肠切成大约 10 cm 长的片段。将它们放在碎冰块上的冷的玻璃培养皿中。





3. 用一只玻璃片的边缘或一只小木棒轻轻地挤压并除去残余的食物颗粒及黏液。

4. 从每一块小肠片段上用稍大些的压力刮下并收集黏膜细胞。

5. 将黏膜细胞悬于 50 ml 的匀浆缓冲液中（总体积为 60 ml）。

匀浆缓冲液：0.25 mol/L 蔗糖，10 mmol/L TES，pH 7.5，1 mmol/L EDTA（360 mg/L），PMSF（36 mg/L），亮抑蛋白酶肽半硫酸盐，0.1% 乙醇

6. 用一只 Potter-Elvjhem 聚四氟乙烯-玻璃匀浆器缓慢地往复捣一次（研杵的转速为 1500 r/min），然后再快速地捣 5~6 次，从而使细胞匀浆化。

7. 将匀浆液于 3300 g（在 Sorvall SS-34 转头中为 5250 r/min) 离心 10 分钟。

8. 保留上清。用相当原来匀浆缓冲液一半体积的缓冲液往复捣两次将沉淀重新匀浆化。

9. 将匀浆液于 3300 g 离心 10 分钟。保留上清。

10. 如前所述重新将沉淀匀浆化然后离心 10 分钟。

11. 弃去沉淀并将所有的上清合并在一起。

12. 将合并的上清于 25000 g（在 SS-34 转头中为 14500 r/min）离心 20 分钟。

13. 将沉淀重悬于 15 ml 匀浆缓冲液中，在一只小的（20 ml）P-E 匀浆器中手工匀浆。

14. 将匀浆液于 25000 g 离心 20 分钟。

15. 倒出上清，将沉淀重悬于 10 ml 的匀浆缓冲液中，柔和地手工匀浆（=L 组分）。

16. 用线性梯度发生器（如，Bio-Rad 产品），在用于垂直转头（Beckman 344326）超速离心的速封离心管中制备两个 40 ml 的 20%~40%线性 Accudmz 梯度。

17. 用一只套在皮下注射器的长针头将 2 ml 的 50% Accudenz 从管顶注射到每一梯度的底部。

18. 在每只管的梯度之上加载 2 ml 的 L 组分。

19. 以 50000 g（在 Vti 50 转头中为 40000 r/min）离心 60 分钟。

20. 将一只长针头从每只管的上面导入至管底，用一只采用细的（14号）Tygon 管的蠕动泵缓慢地（0.5 ml/min）自管底而上将内容物泵出。用自动分部收集器按每 2 ml 一个分部进行收集。

21. 通过确定每一分部的密度和蛋白质浓度（考马斯亮蓝 G-250 结合试验）来定位过氧化物酶体-富集的分部。

22. 分析每一分部的标志酶来鉴定含有微体的分部。

23. 将含有微体的分部合并后于 4℃ 对 0.25 mol/L 蔗糖，10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5 1 mmol/L EDTA 溶液透析以除去 Accudenz。