将核糖体解离为大亚基和小亚基

1. 通过将核糖体样品对解离缓冲液透析并用 7%~30% 的线性蔗糖梯度离心来将真细菌 70S 核糖体分离为 30S 和 50S 亚基。

解离缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

1 mmol/L MgOAc

100 mmol/L NH₄Cl

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L EDTA

2. 测量样品在 A₂₆₀ 下的光吸收，将样品用解离缓冲液稀释至每毫升 100~150 A₂₆₀。

3. 将样品于 4℃ 对解离缓和液透析 5 分钟。

4. 用解离缓冲液制备 7% 和 30% 的蔗糖溶液。用 Millipore 过滤蔗糖溶液。

5. 线性蔗糖梯度可以按前述方法在 Beckman Vti 50 转头配套的管中制备。制备 37 ml 梯度和 2 ml 样品。在梯度的制备中，应自下而上地先向管底倒入 18.5 ml 7% 蔗糖溶液，然后倒入 18.5 ml 30% 的蔗糖溶液，从而使浓度渐高的蔗糖将低密度的蔗糖托起。于 4℃ 放置 2~16 小时使梯度形成。

6. 于 42℃ 保温 5 分钟使样品热激活，然后向每个梯度中加载 150~200 A₂₆₀ 单位的样品。

7. 将梯度于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g ) 离心 70 分钟。

8. 对梯度进行分部收集（每 30 滴为一个分部），确定 A₂₆₀ 曲线，分别倒出单个亚基峰的收集液，用 Beckman 50.2 Ti 转头以 30000 r/min 离心 16 小时来沉淀亚基。

9. 为确保每一亚基样品中含有的其他亚基或其他蛋白质的污染少于 0.5%，可以将亚基作两次梯度离心。

10. 将亚基沉淀物存于 -80℃ 中长期贮存。为便于使用，将沉淀重悬于少量体积的贮存缓冲液中并贮存于 -80℃。

贮存缓冲液：

20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

10 mmol/L MgOAc

100 mmol/L NH₄CI

1 mmol/L DTT

0.5 mmol/L EDTA

60% 甘油

11. 用 1.5 % 的琼脂糖凝胶电泳确定亚基的纯度。从每一份样品中取一份与等体积的 RNA 凝胶上样缓冲液混合，缓冲液为 0.5% 的 SDS，40% 蔗糖的水溶液。

(1) 哺乳动物核糖体

① 将多核糖体沉淀重悬于哺乳动物解离缓冲液中，于 4℃ 保温 15 分钟。

哺乳动物解离缓冲液：

50 mmol/L 盐酸三乙醇胺，pH 7.5

5 mmol/L MgCl₂

500 mmol/L KCI

1 mmol/L 嘌呤霉素

② 保温后，加入 MgCl₂ 至终浓度为 50 mmol/L。将样品用 Beckman Ti 60 转头于 4℃ 以 305000 g 离心 5 小时。将沉淀重悬于不含嘌吟霉素的解离缓冲液中。

③ 用不含嘌呤霉素的解离缓冲液制备 10% 和 40% (w/w) 的蔗糖溶液。如同真细菌核糖体亚基解离方法中描述的一样，将 0.5 ml 等份铺于 12 ml 的 10%~40% 线性蔗糖梯度之上。

④ 将梯度用 Beckman SW41 转头于 4℃ 以 190000 g 离心 5 小时。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。

(2) 叶绿体核糖体

① 将核糖体沉淀重悬于叶绿体解离缓冲液中：

叶绿体解离缓冲液：

10 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

50 mmol/L NH₄CI

0.1 mmol/L MgOAc

6 mmol/L β-巯基乙醇

② 用以上缓冲液制备 7%~30% 的线性蔗糖梯度。按照真细菌核糖体亚基解离步骤中的方法制备梯度。

③ 将样品铺于梯度之上，然后用 Beckman VTi 50 转头于 4℃ 以 50000 r/min ( 242000 g）离心 70 分钟。后续步骤同真细菌核糖体分离方法中的一样。