用生物素-亲和素复合物观察选择性标记糖蛋白

一、过碘酸钠氧化糖蛋白样品

1. 在 0.1 mol/L 醋酸钠 pH 4.5 缓冲液（50 mmol/L 磷酸钠，pH 7.4 ) 中制备蛋白溶液，在冰上预冷。

2. 用水制备新鲜的 0.5 mol/L 过碘酸钠原液，暗处保存，并在冰上预冷。

3. 加足够新鲜的过碘酸原液至蛋白样品中使成至 10 mmol/L ( 1 mmol/L )。

4. 在室温下避光保存 1 小时，或在 4℃ 保存 4~24 小时（冰上 30 分钟）。

5. 加入 1/10 体积的 0.5 mol/L 1，2-亚乙基二醇终止反应。

6. 用 TCA/DOC 沉淀蛋白，按照 PNGaseF 方案第4步所述进行。

7. 冷丙酮清洗沉淀物两次。或者通过对 PBS 透析去除 1，2-亚乙基二醇。至此，样品可以进行生物素化。

二、用生物胞素酰肼生物素化醛基

1. 在 DMSO ( 或 DMF) 中制备生物胞素酰肼的贮备液，冷冻保存。

2. 将过碘酸氧化后获得的沉淀悬浮于 pH 7.4，100 mmol/L 的磷酸钠中，并滴定到 pH 7 ( 用 pH 试纸和每 0.5 μl —份的 1 mol/L 的 Na₂HPO₄）。

3. 加 1/10 体积的生物胞素酰肼原液，在室温下保温样本 1 小时。

4. 按照 PNGaseF 方案中第4步所述的方法用 TCA/DOC 沉淀生物素化样品，以制备 SDS-PAGE 样品。

三、用过碘酸生物胞素酰肼检测固定于膜印迹上的蛋白

1. 在 PBS 中，用 1% BSA 封闭固定有蛋白的 PVDF 膜。

2. 用 PBS 清洗印迹膜三次，用 0.1 mol/L pH 4.5 的醋酸钠清洗一次。

3. 膜在含 10 mmol/L 过碘酸钠的 0.1 mol/L pH 4.5，醋酸钠溶液中，室温下避光保温 1 小时。

4. 用 PBS 清洗印膜 3 次。

5. 用含 3 μg/ml 的生物胞素酰肼的 PBS 溶液覆盖在印膜上，放在室温下 1 小时。

6. 用 PBS 清洗 3 次，并且用链亲和素-HRP 进行染色。