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        单层培养细胞的透化

        相关实验:透化细胞和退化细胞器中蛋白质的磷酸化实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 约在实验开始前 1 小时,将细胞培养物换上含有预热(37℃)的 20 mmol/L HEPES(pH 7.2)的培养基,继续培养。让细胞在实验前与新培养基达成平衡。

        2. 将所需数量的有细胞的培养基放在一个丝网托盘上,放入 37℃ 温箱再平衡 10 分钟。细胞在这种状态下能保持稳定 1 小时左右,这取决于培养基的蒸发速度。

        3. 吸去培养基,立刻用预热的胞外缓冲液冲洗。

        4. 去胞外缓冲液,换上透化缓冲液,加 60 单位/ml 的链球菌溶血素 O 储存液至终浓度 0.6 单位/ml。同时加 10 mmol/L 的冷 ATP 储存液至终浓度 100 μmol/L。

        5. 37℃ 孵育处理过的细胞 1~5 分钟。

        6. 加 [γ-32P] ATP 储存液至终浓度 50~500 μCi/mI。

        7. 加入要研究的实验试剂,如药理试剂、多肽、Fab' 片段,放置一段时间让它们发挥作用。

        8. 加入所需的受体激动剂。

        9. 制备用于免疫沉淀分析的样品或者聚丙烯酰胺凝胶电泳样品。

        来源:丁香实验

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