用丙烯酰胺-尿素凝胶纯化RNA

1. 准备下列溶液：

TBE 缓冲液：Tris 碱 54 g，硼酸 27.5 g，0.5 mol/L EDTA ( pH 8.0)  20 ml，溶解并加水至 1000 ml。当发现贮存液有白色沉淀时应予抛弃。

丙烯酰铵溶液：丙烯酰胺 77.3 g，N,N'-亚甲双丙烯酰胺 27 g，尿素 420 g，5xTSE 200 ml，加水至 1000 ml 充分搅拌溶解固体成分，用 Whatman 3MM 滤纸或微孔滤器过滤。该溶液在棕色瓶中可稳定保存几个月。

10% 过硫酸铵水溶液：TEMED (可从 Sigma 购得）

2X RNA 染色液（10ml)：二甲苯腈蓝 10 mg，溴酚蓝 10 mg，EDTA (二钠盐） 35 mg，甲酰胺 6 ml，5xTBE 4 ml。



2. 分别取一块平整的和一块有凹口的玻璃板，在它们中间放一条 0.5 mm 厚的分隔条并将它们夹紧。用黏胶带封住底部。

3. 往 10 ml 8% 丙烯酰胺溶液中加 100 μl 过硫酸铵及 10 μl TEMED，混匀，倒入两块玻璃板之间至 3 cm 高，让丙烯酰胺溶液聚合。

4. 往 50 ml 8% 丙烯酰胺溶液中加 500 μl 过硫酸铵及 50 μl TEMED，混匀，倒入两块玻璃板之间，确保不要留有气泡。

5. 往凝胶中插入合适的梳子，使之聚合。

6. 凝胶聚合后，将之插入配套的凝胶电泳装置，加 1xTBE，于 200 V 电泳 3 小时，以去除未聚合的丙烯酰胺与过剩的催化剂。

7. 用 TE 溶解 RNA，取 5~10 μl RNA 溶液与等量染色液混合。

8. 于 65℃ 加热 RNA 样品 2 分钟，轻微离心以沉淀不溶物质。

9. 将可溶的 RNA 样品与染料标记物加入凝胶电泳孔。

10. 先用低压（100V) 开始电泳，一旦蓝色与绿色染料分开后，将电压升至 500~700 V。

RNA带负电，向阳极迁移。

11. 于 50℃ 电泳约 3 小时直至绿色染料跑到凝胶底部。

12. 电泳结束后，用刮刀撬起一块玻璃板，拿开，让凝胶留在第二块玻璃板上。

13. 用吸水纸擦去残留液体，用一块塑料薄膜将整个凝胶盖住。

确保凝胶于与塑料薄膜之间没有气泡。

14. 贴上两张黏的带有放射件墨水的斑点标签，以便下一步安放凝胶与 X 射线片。

15. 在暗室里将 X 射线片放到凝胶上面，在 X 射线片上再依次放一张增感屏与一块玻璃板，最后用铝箔将整个装置包起来。

16. 如果 RNA 不用作进一步分析，则将凝胶转移到一张 Whatman 3MM 滤纸上，用商用凝胶干燥器抽干。

17. 于室温、4℃ 或 -70℃ 曝光一段合适的时间，然后显影。