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        四膜虫细胞核的分离

        相关实验:四膜虫细胞核的分离实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 检测所用细胞数量。

        2. 收获细胞前在冷环境中强力搅拌时,在所有溶液中加入蛋白酶抑制剂。

        3. 在培养基 A 中加入辛醇,混合均匀。

        在培养基 A 中加入辛醇和 PMSF,即为培养基 B。

        4. 用吊桶式转头在 250 ml 的圆锥离心瓶中于 2℃,1500~2000 g 离心 5 分钟收获细胞。

        5. 快速倒出上清,搅拌松动沉淀。

        6. 直接在培养基 B 中重悬沉淀细胞。

        细胞破碎

        7. 在冷的搅拌机中高速搅切 30~60 秒破碎细胞。

        8. 用光学显微镜检查匀浆物,载玻片上放少量匀浆物,加上甲基绿。保证小核已从其临近大核的“杯状”处被移去。

        差异核片状沉淀

        9. 将搅拌过的细胞倒入圆锥形离心瓶中,用吊桶式转头在 0~4℃ 于 1500~2000 g 离心 5 分钟。可用 50~250 ml 的离心瓶。

        10. 轻微摇动瓶,使上清表面形成的表层松动,将上清和表层倒入冷的搅切机中。

        11. 用少量细胞核洗涤缓冲液重悬片状沉淀,用甲基绿染色后在光学显微镜下仔细观察小量、检测大核和小核的数量。

        12. 将片状沉淀收集到试管中,标记为 Pn。

        13. 高速搅切上清 20 秒,用较高速度离心 5 分钟。

        14. 收集上清,在细胞核洗涤缓冲液中重悬片状沉淀,按照步骤 11 检测细胞核。

        15. 重复搅切和离心,提高离心速度,分析每次的片状沉淀,直到沉淀中几乎没有大核为止。

        16. 当最后观察的片状沉淀中小核为大多数时,高速搅切上清 20 秒,用吊桶式转头在 0~4℃ 于 5000 g 离心 5 分钟。

        17. 收集上清,将片状沉淀悬于细胞核洗涤缓冲液中,按照步骤 11 检测片状沉淀。

        计数分离的细胞核总数

        18. 集中适当的含有大核的片状沉淀;小核也同样。用细胞核洗涤缓冲液重悬核于适当的体积内。

        19. 用甲基绿稀释少量的大核或小核。用分光光度计计数细胞核数量,计算基于起始细胞的数目。假定生长或饥饿过程中每个细胞有一个大核和一个小核;接合过程中每个细胞的细胞核数量依赖于所处阶段有很大变化。

        20. 当大核和/或小核收量合适,可在 0~4℃ 于 2000 g 离心 5 分钟收获细胞核。

        21. 在少量细胞核洗涤缓冲液中重悬细胞核,用小离心管离心 5 分钟洗涤细胞核。

        来源:丁香实验

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