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        用T4噬菌体DNA聚合酶标记双链DNA的3'端

        相关实验:用 T4 噬菌体 DNA 聚合酶标记双链 DNA 的 3'端

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        醋酸氨(10 mol/L)

        乙醇

        酚:氯仿(1:1,V/V)

        2. 酶和缓冲液

        适当的限制性内切核酸酶

        T4 噬菌体 DNA 聚合酶

        10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液

        3. 核酸和寡核苷酸

        含三种来标记的 dNTP 溶液,浓度各为 2 mmol/L

        含一种未标记的浓度为 2 mmol/L 的 dNTP 的溶液

        模板 DNA ( 0.1~5 μg )

        4. 放射性复合物

        [α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)

        5. 专用设备

        Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡

        预设定至 70℃ 的水浴

        二、方法

        1. 用产生平端或 3' 突出端的限制酶消化 0.1~5.0 μg 模板 DNA。

        2. 用酚: 氯仿抽提及在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下用乙醇沉淀纯化 DNA。

        3. 将 DNA 沉淀溶于:

        10X T4 噬菌体 DNA 聚合酶缓冲液       2 μl

        2 mmol/L 三种未标记的 dNTP 溶液     1 μl

        10 mCi/ml [α-32P] dNTP

        ( 800~3000 Ci/mmol)                       1 μl

        T4 噬菌体 DNA 聚合酶(2.5 单位/μl) 1 μl

        水                                                     加至 20 μl

        37℃ 温育 5 min。

        4. 加入 1 μl 2 mmol/L 未标记的第四种 dNTP 溶液,继续温育 10 min。

        5. 70℃ 加热 5 min 以终止反应。

        6. 用 Sephadex G-50 离心柱层析或在 2.5 mol/L 乙酸铵的存在下进行两轮乙醇沉淀分离标记的 DNA 与未掺入的 dNTP。

        来源:丁香实验

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