克隆化的PCR产物连入T载体

由 Taq DNA 聚合酶 PCR 扩增产生的带 3' 突出端为 A 碱基的 DNA 片段能高效地克隆至 T 载体上，这种 T 载体有与 A 碱基互补的未配对 3' T 碱基（Holton and Graham 1991; Marchuk et al. 1991)。

一、材料

1. 酶与缓冲液

噬菌体 T4 DNA 连接酶

2. 凝胶

琼脂糖凝胶

3. 核苷酸与寡核苷酸

PCR 扩增的靶 DNA ( 25 μg/ml)

4. 载体

T 载体

5. 特殊设备

预设水温在 14℃ 的水浴箱

二、方法

1. 在一只微量离心管内，依次加入下列连接混合液：

25 μg/ml 扩增靶序列 DNA 1 μl

T 质粒                              20 ng

10X 连接缓冲液                1 μl

噬菌体 T4 DNA 连接酶      3 单位

H₂O 补足至                     10 μl

2. 将连接混合液在 14℃ 温育 4 h。

3. 将上述两支试管内的连接反应混合液样品各取 5 μl，用 10 μl H₂O 稀释后，转化具有抗生素抗性的感受态大肠杆菌受体菌。将这种转化菌液涂布在含有合适抗生素和 IPTG 与 X-gal 的培养基的平皿上。

4. 计算实验组与对照组在培养皿上的菌落数。挑取可能含有靶基因 DNA 插入片段的白色菌落进行培养扩增，抽提质粒 DNA，利用质粒多克隆位点内的插入外源 DNA 片段侧翼的酶切位点，用相应的限制性内切核酸酶进行酶切鉴定；也可以直接用菌落 PCR 予以鉴定。

5. 通过琼脂糖凝胶电泳鉴定克隆 DNA 片段的大小（采用合适的 DNA marker分子量作对照）。

6. 利用 DNA 序列分析，限制性内切核酸酶图谱或 Southern 杂交进一步鉴定克隆的靶基因 DNA 片段的正确性。