SDS-PAGE 蛋白质样品的制备

实验过程

将收集的各样品加入等体积的 2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解 5 min，冰浴 2 min，12,000rpm 离心 10 min，取上清-20℃ 保存备用。

SDS-PAGE 蛋白质电泳（参照分子克隆实验指南操作）(萨姆布鲁克,2002)

1）按照电泳装置的使用说明，装好洁净干燥的玻璃板。

2）分离胶的制备

按下列成分配制 10 mL 12% 分离胶：
ddH₂O                                         3.3 mL
30% 丙烯酰胺混合液                   4.0 mL
1.5M Tris(pH8.8)                          2.5 mL
10%SDS                                      0.1 mL
10% 过硫酸铵                              0.1 mL
TEMED                                        0.004 mL
总体积                                         10 mL

各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其小心地注入准备好的玻璃板间隙中，并为积层胶留出足够空间。轻轻在顶层加入一薄层水封顶，以防止空气中的氧对凝胶聚合的抑制作用。凝胶聚合完成后，倒掉覆盖的水层，用水清洗凝胶顶部数次，用滤纸吸干凝胶顶端的水。

3）积层胶的制备

按下列成分配制 2 mL 5% 的积层胶：
ddH₂O                                           1.4 mL
30% 丙烯酰胺混合液                     0.33 mL
1.0M Tris(pH6.8)                            0.25 mL
10%SDS                                        0.02 mL
10% 过硫酸铵                                0.02 mL
TEMED                                          0.002 mL
总体积                                           2 mL

各成分加入后迅速旋涡混匀，用微量移液器将其灌注到分离胶上，灌满后小心插入加样梳，尽可能避免产生气泡。

4）待积层胶凝固后，小心拔下梳子。

5）将凝胶固定于电泳装置上，加入足量的 1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入 20μL 各样品。

6）样品在积层胶中电泳时，使用 80V 电压，待溴酚蓝带进入分离胶后，将电压升至 120V，继续电泳直至溴酚蓝带到达分离胶的底部且开始泳出胶底面，关闭电源。

7）卸下凝胶，将其浸泡在至少 5 倍体积的考马斯亮蓝 R-250 染色液中，置水平摇床上室温染色至少 4 h，之后取出染色的凝胶并回收染液，以备再用，将凝胶浸泡于考马斯亮蓝脱色液中，在水平摇床上脱色 4~8 h，其间更换脱色液 3~4 次，直至凝胶脱色到条带清晰为止，观察记录结果并拍照。