用甲酰胺从哺乳动物细胞中分离高分子质量DNA

本方案是 Kupiec 等所述方法（1987) 的改良版本，包括用蛋白酶 K 消化细胞和组织，用高浓度甲酰胺分离 DNA-蛋白质复合物（染色质用火棉胶袋充分透析去除蛋白酶和有机溶剂等过程。甲酰胺是一种离子化溶剂，能分离蛋白质-DNA 复合物并使蛋白变性和释放，但他并不明显影响蛋白酶 K 的活性。用本程序制备的基因组 DNA 很大 7200 kb，适于用高包装容量载体构建文库及通过脉冲凝胶电泳分析大片段 DNA。本方法有两个缺点：比其他方法需要更多的时间；所制备 DNA 的最终浓度颇低（约 10 μg/ml )。从 1X10⁸ 培养的非整倍体哺乳类细胞（如 HeLa 细胞）中大约可制备 1 mg 高分子质量 DNA。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

透析缓冲液 1（20 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，0.1 moI/L NaCl，10 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，制备 6 L 透析缓冲液 1，储于 4℃。）

透析缓冲液 2（10 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0)，10 mmol/L NaCl，0.5 mmol/L EDTA ( pH 8.0)，制备 6 L 透析缓冲液 2，储于 4℃。）

甲酰胺变性缓冲液（20 mmol/L Tris-Cl ( pH 8.0)，0.8 mol/L NaCI，80% (V/V) 甲酰胺）

TE ( pH 8.0)

2. 凝胶

脉冲电场凝胶或 0.6% 琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷酸

λ 噬菌体的线性单体和多联体

4. 专用设备

带有不锈钢杯的搅拌器（用于组织）

火棉胶袋

尖头去除的黄色尖头

透析管夹

玻璃棒

预置于 15℃ 的水浴或孵箱

预罝于 50℃ 的水浴

5. 细胞和组织

单层或悬浮培养的哺乳类细胞，或新鲜组织，或血样

二、方法

1. 采用方案 1 步骤 1~4 制备细胞悬液（或冰冻细胞粉末）的裂解液。

2. 将含有裂解细胞和裂解缓冲液的溶液冷却至 15℃。每 1 ml 细胞裂解液加 1.25 ml 甲酰胺变性缓冲液，用玻璃棒温和地混匀溶液。将溶液在 15℃ 放置 12 h。

3. 将黏滞的溶液灌入一个或者多个火棉胶袋中。透析袋开口用透析管夹封住，在 4℃ 于 2 L 裂解缓冲液 1 中透析 45 min。换新鲜缓冲液 1 并继续透析至少 4 h 后，再换 2 L 新鲜透析缓冲液 1 透析另外 4 h。将 DNA 在 2 L 新鲜透析缓冲液 2 中透析 3 次，每次至少 4 h。

4. 测定 DNA 的浓度。

5. 脉冲凝胶电泳或者常规的 0.6% 琼脂糖凝胶电泳。用 λDNA 单体或者线性多联体作为分子质量标记。基因组 DNA 大小将超过 200 kb。