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        琼脂糖凝胶中DNA的回收(DEAE-纤维素膜电泳)

        相关实验:琼脂糖凝胶中DNA的回收(DEAE-纤维素膜电泳)

        最新修订时间:

        原理

        从琼脂糖凝胶回收 DNA 是通过电泳至带正电荷的 DEAE-纤维素膜上完成的。这种方法首先利用适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段,然后紧靠目的 DNA 片段条带前方切一裂缝。将一长条 DEAE 纤维素膜插入裂缝。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        乙酸铵(10 mol/L)

        DEAE 高盐洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),1 mol/L NaCI,10 mmol/L EDTA (pH 8.0))

        DEAE 低盐洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),0.15 mol/L NaCl,10 mmol/L EDTA (pH 8.0))

        EDTA ( 10 mmol/L,pH 8.0)

        乙醇

        6X 凝胶载样缓冲液

        0.5 mol/L NaOH

        酚: 氯仿(1:1,V/V)

        醋酸钠(3 mol/L,pH 5.2)

        TE ( pH 8.0)

        2. 酶和缓冲液

        限制性内切核酸酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶,含有 0.5 ug/ml 的 EB

        4. 核酸和寡聚核苷酸

        DNA 样品

        DNA 标准

        RNA,酵母转运 tRNA

        5. 专用设备

        DEAE 纤维素膜

        手提式长波紫外灯

        65℃ 水浴

        二、方法

        1. 消化一定量 DNA 以收获至少 100 ng 目的片段 DNA。用含有 0.5 ug/ml EB 的适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 片段。用手提式长波紫外灯对目的条带进行定位。

        2. 用锋利的刀片或剃刀在紧靠目的条带前的凝胶上切一切口,其两边比条带宽约 2 mm。

        3. 戴上手套,切一块与切口等宽而比凝胶稍深(1 mm )  的 DEAE 纤维素膜。在 10 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 室温浸泡 5 min 后,用 0.5 mol/L NaOH 取代 EDTA 浸泡以活化 DEAE 纤维素膜。再次室温 5 min 后,用无菌水冲洗 6 次。

        4. 用平头镊子将切口壁撑开,将膜插入裂缝中。取出镊子,使切口闭合,小心勿留气泡。

        5. 继续电泳(<5 V/cm) 直至 DNA 条带迁移到膜上。电泳过程中,可以用手提式长波紫外灯(302 nm ) 进行跟踪检测。

        6. 当所有目的 DNA 离开凝胶被收集到膜上时,切断电流。用平头镊子从凝胶中取出膜,室温下,用 5~10 ml DEAE 低盐缓冲液将膜漂洗一下,以除去膜上的琼脂糖。

        7. 将膜转移到另一个微量离心管中,加足量的 DEAE 高盐洗脱缓冲液使膜完全被浸没。轻轻的将膜弄皱或对折,但不要压紧。盖上离心管盖,于 65℃ 温育 30 min。

        8. 从膜上洗脱 DNA 的过程中,对凝胶成像,记录被分离出的条带。

        9. 步骤 7 的液体转移到另一微量离心管,再加入足量的 DEAE 高盐洗脱缓冲液,于 65℃ 温育 15 min。合并两份 DEAE 高盐溶液。

        10. 高盐洗脱液用酚:氯仿抽提一次。水相转移到另一离心管。加入 0.2 倍体积的 10 mol/L 乙酸铵,2 倍体积的 4℃ 乙醇。室温放置 10 min。用微量离心机室温以最大转速离心 10 min。用 70% 乙醇小心洗沉淀。打开离心管几分钟,使乙醇完全挥发。再将 DNA 重溶到 3~5 ul TE (pH 8.0)。

        11. 如果需要极纯的 DNA ( 如用于小鼠受精卵的显微注射或培养细胞电穿孔),可以按照下述方法用乙醇再沉淀 DNA。

        (1) 用 200 ul TE(pH 8.0)悬浮 DNA,加入 25 ul 3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2),用 2 倍体积的乙醇重新沉淀 DNA。

        (2) 4℃ 微量离心机最大速度离心 5~15 min, 回收 DNA。

        (3) 70% 乙醇小心漂洗沉淀。打开离心管几分钟,使乙醇完全挥发。将 DNA 溶于 3~5 ul TE ( pH 8.0)。

        12. 通过凝胶电泳对 DNA 进行定性和定量。将少量(10~50 ng) 最终制备的 DNA 片段与 10 ul TE ( pH 8.0) 混合,加入 2 ul 所需的凝胶载样缓冲液。加样并在适当浓度的琼脂糖凝胶上进行电泳,以已知量的经用适当限制酶消化的原 DNA 作为参照物标准和分子质量标准。分离的片段应该与限制酶消化产物中的相应片段同步迁移。仔细检査凝胶,看是否有弱荧光带存在。弱荧光带存在表 明有 DNA 污染。

        注意事项

        1.切胶回收时切下来的部分尽量小,以提高回收效率。

        2.在接触到紫外线照射时,应做好保护措施。

        常见问题

        材料

        1. 缓冲液和溶液

        乙酸铵(10 mol/L)

        DEAE 高盐洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),1 mol/L NaCI,10 mmol/L EDTA (pH 8.0))

        DEAE 低盐洗脱缓冲液(50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0),0.15 mol/L NaCl,10 mmol/L EDTA (pH 8.0))

        EDTA ( 10 mmol/L,pH 8.0)

        乙醇

        6X 凝胶载样缓冲液

        0.5 mol/L NaOH

        酚: 氯仿(1:1,V/V)

        醋酸钠(3 mol/L,pH 5.2)

        TE ( pH 8.0)

        2. 酶和缓冲液

        限制性内切核酸酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶,含有 0.5 ug/ml 的 EB

        4. 核酸和寡聚核苷酸

        DNA 样品

        DNA 标准

        RNA,酵母转运 tRNA

        5. 专用设备

        DEAE 纤维素膜

        手提式长波紫外灯

        65℃ 水浴

        来源《分子克隆实验指南第三版》黄培堂等译。

        来源:丁香实验

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