M13噬菌体液体培养

M13 噬菌体原种通常采用液体培养，感染细胞并不裂解而是缓慢生长形成稀悬液。接种几乎总是用一个新挑取的噬菌斑或单个噬菌斑获得的噬菌体颗粒悬液。感染细胞含 200 拷贝以上双链 RF DNA，每代分泌数百个噬菌体颗粒。

一、材料

1. 培养基

含四环素或卡那霉素的 LB 培养基 或 加富 M9 基本培养基

LB 或 YT 培养基

含 5 mmol/L MgCl₂ 的 2 X YT 培养基

2. 专用设备

无菌牙签或接种针或玻璃毛细管（50 μl )

3. 载体和菌株

铺于琼脂或琼脂糖平板上的 M13 噬菌斑（制备上层琼脂或琼脂糖中的噬菌斑的方法）

大肠杆菌 F' 菌株，生长于琼脂平板上，克隆分离良好。（取适当菌株的主培养物在 M9 基本琼脂平板上划线，对抗生素抗性菌株，则在含适当抗生素的 LB 平板上划线，37℃ 培养 24~36 h。M13 噬菌体的单链 DNA 如果是用于作为寡核苷酸介导的突变则其应在含 dut 和 ung 基因突变的大肠杆菌中增殖。）

二、方法

1. 取带有 F' 质粒的大肠杆菌的一个新长成的单菌落接种 5 ml 加富培养基（对抗生素抗性菌株则用含适当抗生素的 LB 培养基），37℃ 温和振荡 12 h。

2. 取 0.1 ml 培养物接种 5 ml 含 5 mmol/L MgCl₂ 的 2 X YT 培养基，37℃ 剧烈振荡培养 2 h。

3. 将 5 ml 培养物用 45 ml 含 5 mmol/L MgCl₂ 的 2 X YT 培养基稀释，每支 1 ml 分装无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm), 按需增殖的噬菌斑的数量确定试管数，另再分装 2 支作为噬菌体生长的阴性和阳性对照。将这些试管放于一边，步骤 7 使用。

4. 每支 1 ml YT 或 LB 分装无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm), 按需增殖的噬菌斑的数量确定试管数，另再分装 2 支作为噬菌体生长的阴性和阳性对照。

5. 用无菌接种针蘸取噬菌斑表面，在 YT 或 LB培养基中漂洗，制备 M13 噬菌体稀释悬液。挑取一个蓝色噬菌斑作为噬菌体生长的阳性对照，在平板上挑取一处无噬菌斑的大肠杆菌层，作为阴性对照。

6. 悬液室温放置 1~2 h, 使噬菌体颗粒从琼脂中扩散出来。

7. 取 0.1 ml 噬菌体悬液（步骤 6) 感染 1 ml 大肠杆菌培养物（步骤 3) 用于分离病毒 DNA。37℃ 温和振荡培养 5 h。



8. 培养液转到一个无菌微量离心管中，最大转速室温离心 5 min, 不要搅动细菌沉淀， 上清转移至一个新的微量离心管中。

9. 取 0.1 ml 上清置于一个无菌微量离心管中。

10. 剩余的 1 ml 培养上清制备噬菌体单链 DNA。细菌沉淀用于制备双链 RF DNA。