M13 噬菌体铺平板

M13 噬菌斑是由单个病毒感染单个细菌后形成的。子代病毒颗粒感染邻近细菌, 然后又产生下一代病毒颗粒，细菌在半固体培养基（如含琼脂或琼脂糖）上生长时，子代病毒颗粒的扩散受到一定限制。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

IPTG 溶液（20%, m/V)

X-gal 溶液（2%, m/V)

2. 培养基

含四环素或卡那霉素的 LB 琼脂平扳 或 加富的 M9 基本培养基平板

LB 或 YT 培养基

含 5 mmol/L MgCl₂ 的 LB 或 YT 培养基琼脂平板

含 5 mmol/L MgCl₂ 的 LB 或 YT 培养基的上层琼脂或琼脂糖

3. 专用设备

47℃ 加热器或水浴

冰浴

4. 载体和菌株

LB 或 YT 培养基中的 M13 噬菌体原种 或 悬于 1 ml LB 或 YT 培养基中的噬菌斑

大肠杆菌 F' 菌株制备的主培养物

二、方法

1. 取带 F' 质粒的菌株的主培养物在含四环素（XL1-Blue) 或卡那霉素（XL1-Blue MR F'Kan) 的加富 M9 基本琼脂平板或 LB 平板上划线。37℃ 培养 24~36 h。

2. 制备铺板用细菌。挑取步骤 1 制备的平板上单个良好分离的单菌落接种于含 5 ml LB 或 YT 培养基的 20 ml 无菌试管中，37℃ 旋转摇床培养 6~8 h。冰浴冷却 20 min, 贮 存于 4℃。这种铺板用细菌可在 4℃ 保存 1  周以上。

3. 准备装有 3 ml 融化的或 YT 培养基的上层琼脂或琼脂糖的无菌试管（13 x 100 mm 或 17 x 100 mm), 培养基中加入 5 mmol/L MgCI₂, 试管保温在 47℃ 加热器或水浴中。

4. 根据稀释度和噬菌体原种的量（见步骤 5) 标记一系列无菌试管（13 X 100 mm 或 17 X 100 mm)。取 100 μl 步骤 2 制备的菌液加入各试管。

5. 将噬菌体原种用 LB 或 YT 培养基作 10 倍系列稀释（10^-6~10^-9)。分别取 10 μl 或 100 μl 各个稀释度的噬菌体溶液加入步骤 4 制备的含铺板细菌的试管中，在振荡器上轻轻振荡使噬菌体和细菌混合。

与 λ 噬菌体不同，M13 噬菌体吸附细菌很快，因而在加入上层琼脂前不需要将噬前体与铺板细菌温育。

6. 在装有上层琼脂的试管中分别加入 40 μl 2% X-gal 和 4 μl 20% IPTG。马上分别将每管中的内容物倒入一支含感染培养物的试管中，用振荡器温和振荡 3 s，混合培养物与琼脂/琼脂糖。将混合物倒入标记好的含 5 mmol/L MgCl₂，并预先平衡至室温的 LB 或 YT 平板。转动平板以确保菌体和上层琼脂分布均匀。

7. 将步骤 5 准备的含感染培养物的各试管，重复步骤 6 加入含 X-gal 和 IPTG 的上层琼脂。

8. 盖上平皿，室温放置 5 min, 使上层琼脂/琼脂糖凝固。用 Kimwipes 纸中将盖上多余的冷凝水擦干，平板倒置放于 37℃ 培养。