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        电穿孔转染 DNA 实验

        相关实验:电穿孔转染 DNA 实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料

        缓冲液与溶液

        贮存液、缓冲液与试剂的成分见附录 1。
        稀释贮存液至所需浓度

        Giemsa 染液(10%m/V)
        Giemsa 染液应使用前用磷酸盐缓冲液或水新鲜制备的,用 Whatman1 号滤纸过。

        甲醇

        磷酸盐缓冲液
        溶液使用前过滤除菌,室温保存

        丁酸钠(500 mmol/L)(备选)
        在化学通风橱内,用10mol/LNaOH 调节丁酸贮存液至 pH7.0。用 0.22um 的滤器过滤除菌,-20°C 保存

        核酸与寡核苷酸

        载体 DNA(10mg/ml; 如超声处理的鲑精 DNA)(选用)
        线状或环状质粒 DNA(用灭菌去离子水配成 1ug/ul)

        培养基

        细胞生长培养基(完全培养基与选择性培养基)

        离心机与转子

        Sorvall H1000B 转子或类似设备

        特殊设备

        电穿孔设备与电转化池

        基因脉冲器 II(Bio-Rad 公司 Cat.oo.165-2105for 110V U.S.Systems and Cat.no.165-2106 for 220V European Systems)。

        组织培养皿(35 mm)
        此方法适用于用 35 mm 培养皿培养细胞。如果使用其他多孔板、细胞瓶或其他直径的培养皿,按比例改变细胞浓度与试剂的用量,见表 16-3。

        附加试剂
        本方案第 10 步可能需要列于第 17 章方案 7 或方案 1 的备选方案中的试剂。

        细胞与组织

        指数生长的哺乳动物细胞培养液

        方法

        1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞,用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。

        2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞,用血细胞计数器计细胞数目(见附录 8)。

        3. 离心(同步骤 1) 收集细胞,室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。

        4. 将 400ul 的各等份细胞悬液(106~107 细胞)加入标记好的电转化池中,冰浴。

        5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间,不同细胞系所需电压不同,平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。

        6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
        重要:混匀时不要产生气泡。

        7. 立即将电转化池移至电极间放电,1~2 min 后,取出电转化池,冰浴,立即进行下一步操作。

        8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池,洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
        如果要丁酸钠休克(见方案 2 第 5 步),用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池,将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后,吸去含丁酸钠的培养基,加入正常培养基。

        9. 重复第 6~8 步,电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。

        10. 如要获得稳定转化体,直接进行第 11 步。如果是瞬时表达,则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞:

        • 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色

        方法操作。

        • 如果使用绿色荧光蛋白表达载体,在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。

        方法

        1. 细胞生长到对数中期或晚期时收集细胞,用包有橡皮的玻璃棒或胰酶释放贴壁细胞。4°C、500 g 离心 5 min(Sorvall H1000B 转子用 1500r/min)。

        2. 用 0.5 体积的初始培养基重悬细胞,用血细胞计数器计细胞数目(见附录 8)。

        3. 离心(同步骤 1) 收集细胞,室温下用培养基或磷酸盐缓冲液重悬细胞至 2.5X106~2.5X107 细胞/ml。

        4. 将 400ul 的各等份细胞悬液(106~107 细胞)加入标记好的电转化池中,冰浴。

        5. 设置电转化参数。一般电容量为 1050uF。电压在 200V 至 250V 之间,不同细胞系所需电压不同,平均为 260V。内部阻抗设为无穷大。进行电穿孔前先用一个装有 PBS 的电转化池放电至少两次。

        6. 每一装有细胞的电转化池内加入 10~30ug、体积最大可至 40ul 的质粒 DNA。[有些人加入载体 DNA(如鲑精 DNA) 使 DNA 总量至 120ug。] 用吸管将 DNA 与细胞轻轻混匀。立刻继续进行第 7 步。
        重要:混匀时不要产生气泡。

        7. 立即将电转化池移至电极间放电,1~2 min 后,取出电转化池,冰浴,立即进行下一步操作。

        8. 用带有高压灭菌吸头的微量移液器将电穿孔的细胞转移至 35 mm 培养皿中。用等体积的培养基洗涤电转化池,洗液加人培养皿。培养皿置于含 5%~7%CO2 的 37°C 孵箱。
        如果要丁酸钠休克(见方案 2 第 5 步),用含适量丁酸钠的培养基洗涤电转化池,将洗液与转化的细胞合并后再孵育。24 h 后,吸去含丁酸钠的培养基,加入正常培养基。

        9. 重复第 6~8 步,电转化所有 DNA 与细胞样品。记录下每一电转化池的实际脉冲时间以便于比较。

        10. 如要获得稳定转化体,直接进行第 11 步。如果是瞬时表达,则于电穿孔 24~96 h 后用下述方法之一检测细胞:

        • 如果使用的是表达 E.coli β-半乳糖苷酶的质粒 DNA 按第 17 章方案 7 所列操作步骤检测细胞裂解液中酶活性。或者按照方案 1 的附加方案中介绍的组化染色方法操作。
        • 如果使用绿色荧光蛋白表达载体,在 450~490nm 光照下用显微镜检测细胞。
        • 如果使用其他基因产物,则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。
        为减小不同培养皿之间转染效率的差异,最好(1)用每一构建体转染数个培养皿;(2)孵育 24 h 后用胰酶消化细胞;(3)将细胞汇集起来;以及(4)重铺细胞于数个培养血上

        11. 分离稳定转染体:用完全培养基培养 48~72 h 后,胰酶消化细胞,用适当的选择性培养基重铺细胞。每 2~4 天换液一次,持续 2~3 周,目的是去除死细胞残骸,并允许抗性细胞克隆生长。此后,克隆、繁殖独立克隆以用于检测 [方法见 Jakoby and Pastan 1979 或 Spector et al.1998b(〈细胞实验手册〉 的第 86 章)]。

        用预冷的甲醇固定细胞 15 min, 然后室温下用10% Giemsa 染色 15 min, 流水冲洗,这样可以记录细胞克隆数目 Giemsa 染液应在使用前用磷酸盐缓冲液或水新配置,用 Whatman l 号滤纸过滤。 如果使用其他基因产物,则通过体内代谢标志物进行放射免疫、免疫印渍、免疫沉淀或测定细胞提取物的酶活性来分析新合成蛋白。

        来源:丁香实验

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