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        用λ噬菌体 PL 启动子在大肠杆菌中表达克隆基因实验

        相关实验:用λ噬菌体 PL 启动子在大肠杆菌中表达克隆基因实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料

        缓冲液和溶液

        贮存液、缓冲液和试剂的成分参见附录 1。
        贮存液稀释至适当浓度。

        考马斯亮蓝染色溶液或银染溶液
        参见附录 8。

        1XSDS 凝胶加样缓冲液
        不含 DTT 的 1xSDS 凝胶加样缓冲液室温保存,1mol/LDTT 贮存液现用现加于上述缓冲液。

        L-色氨酸(10 mg/ml)

        凝胶

        SDS-聚丙烯酰胺凝胶(10%)
        用于分离蛋白的 SDS-聚丙烯酰胺凝胶的制备参考附录 8。

        核酸和寡核苷酸

        靶基因或 cDNA 片段

        培养基

        LB 琼脂平板
        LB 培养基
        根据所用载体在培养基中加入不同的抗生素。

        加热到 65°C 的 LB 培养基
        备选,参见步骤 13。

        M9 基本培养基
        灭菌后补加 0.5%(m/V) 葡葡糖,0.2%(m/V) 酪蛋白酸水解物和所需抗生素,用于色氨酸诱导的表达载体。

        离心机和转头

        SorvallGSA 转头或相当的转头

        特别配备

        沸水浴

        设定为 30°C 和 40°C 的振荡培养器
        只有使用λ噬菌体 cI 基因的温度敏感型等位基因时才需要。

        补充试剂

        本方案步骤 1 需要第 8 章方案 7 中所列试剂。
        本方案步骤 2 需要第 1 章方案 17 或 19 中所列试剂。
        本方案步骤 3 需要第 1 章方案 23~26 中所列试剂。
        本方案步骤 4 需要第 12 章方案 3 中所列试剂。

        载体和细菌菌株
        带有λ噬菌体 cI 基因的 cIts857 等位基因或野生型等位基因的大肠杆菌菌株在 M5219 菌珠中是热诱导的 clts857 等位基因,在 GI724 菌珠 (ATCC55151cI 基因)中是色氨酸诱导的野生型 cI 基因。

        PL 表达载体(如 pHUB,pPLc,pKC30,pASl,pCQV2,pAL-781 和 pTrxFus)

        阳性对照质粒(表达已知大小融合蛋白的 PL 表达载体)

        方法

        含重组表达载体的大肠杆菌菌株的构建

        1.PCR 修饰(第 8 章方案 7) 或限制性内切酶消化分离 DNA 片段,片段 5'端和 3'端带有与 PL 表达载体对应的限制酶位点。
        必要时可在 cDNA/基因的 ATG 上游置入强的核糖体结合位点。
        为确定扩增反应没有引入错误突变,应对 PCR 产物进行序列分析。

        2. 靶 cDNA/基因的 DNA 片段与表达载体连接(第 1 章方案 17 或 19)。

        3. 连接产物转化含有 cIts857 等位基因或野生型 cI 基因的大肠杆菌菌株。将转化体铺于含相应选择抗生素的 LB 平板(通常为 50ug/ml 的氨苄青霉素),于 30°C(含有cIts857 等位基因)或 37°C(含有色氨酸诱导的野生型 cI 基因)过夜培养。
        空的表达质粒转化相同的大肠杆菌菌株作阴性对照。

        4. 通过菌落杂交和/或小量制备质粒的限制酶切分析、寡核苷酸杂交或序列分析筛选带有插入片段的转化体(请参见第 12 章方案 3)。

        诱导靶蛋白表达的优化
        许多研究表明细胞生长速率严重影响外源蛋白的表达,因此必须对接种细菌量、诱导前细胞生长时间和诱导后细胞密度进行控制。生长过度或过速都会加重细菌合成系统的负担,导致形成包涵体。

        5. 通过提髙温度或加入色氨酸,下调 cI 阻抑蛋白,诱导靶蛋白表达,筛选最佳表达条件。
        影响诱导表达的因素请参见方案 1 步骤 8 的注解。

        对于溫度诱导系统

        a. 对照菌和重组菌分别挑取 1~2 个菌落,接入 1 ml 含所需抗生素的 LB 培养液,30°C 培养过夜。
        编码己知大小蛋白的表达载体作阳性对照。

        b. 取 50ul 接入 10 ml 含抗生素的 LB 培养液,在 50 ml 摇瓶中于 30°C 培养至对数中期(A550=0.5?1.0)。

        c. 吸出 lml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤 6 和 7 所述进行处理。

        d. 调整温度至 40°C, 诱导剩余培养物。继续步骤 6。
        尽管在本书其他章节中采用 42~45°C 灭活λ噬菌体 cIts857 阻抑物,但此处采用40°C 以便减少热激蛋白的诱导并使细菌能够继续生长。

        对于色氨酸诱导系统

        a. 含空载体和重组表达载体的大肠杆菌(带有 cI 野生型等位基因)分别挑取 1~2个菌落,接入 1ml 补充 M9 培养液,37°C 培养过夜。
        编码已知大小蛋白的表达载体作阳性对照。

        b. 取 50ul 接入 10 ml 补充 M9 培养液,在 50 ml 摇瓶中于 37°C 培养至对数中期(A550=0.5~1.0)。

        c. 吸出 1 ml 未经诱导的培养物放在一个微量离心管中,按下面步骤 6 和 7 所述进行处理。

        d. 剩余培养物中加入色氨酸至终浓度 100ug/ml,37°C 继续培养。

        6. 诱导不同时间(如 1、2、4 和 6 h) 后取 1ml 样品放于微量离心管中,测定A550, 室温高速离心 1 min。

        7. 沉淀悬于 100ul 1XSDS 凝胶加样缓冲液,100°C 加热 3 min, 室温高速离心lmin,冰上放置,待全部样品处理完后上样。

        8. 样品加热至室温,取 40ug 或相当于 0.15 OD550 培养物的悬液上样于 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶。

        9.8~15V/cm 电泳,至溴酚兰迁移到分离胶底部。

        10. 考马斯亮蓝染色或银染,或免疫印迹,观察表达产物条带(见附录 8)。
        未转化的大肠杆菌细胞和转化了空载体的细胞,蛋白质带形应该没有区别。诱导一定时间的重组菌应有一条与预计大小一致的带。

        大量表达靶蛋白

        11. 挑取一个重组大肠杆菌菌落接入 50 ml 含抗生素的 LB 培养液或补充 M9 培养液,
        在 250 ml 摇瓶中于 30°C 或 37°C 过夜培养。

        12. 取 50 ml 过夜培养物接入 450 ml 含抗生素的 LB 培养液或补充 M9 培养液,在 2L 摇瓶中于 30°C 或 37°C 振荡培养至对数中期(A550=0.5~1.0), 按步骤 13 或 14 进行诱导。

        13. 加入 500 ml 加热至 65°C 的 13 培养基,诱导带 cIts857 等位基因的大肠杆菌。40°C培养预试验确定的最佳时间。或者于室温以 12000 g(8600r/min Sorvall 转头)离心 5 min 收集细胞,沉淀重悬于 500 ml40°C 的LB 培养基,40°C 继续培养预试验确定的最佳时间。

        14. 加入色氨酸至终浓度100ug/ml, 诱导带 cI 等位基因的大肠杆菌。37°C 继续培养预试验确定的最佳时间。

        15. 诱导适当时间后,于 4°C 以 5000 g(5500r/min Sorvall GSA 转头)离心 15 min 收集细胞,继续后面的纯化方案:

        • 如果表达的是 GST 融合蛋白,继续方案 5

        • 如果表达的是麦芽糖结合蛋白融合蛋白,继续方案 6

        • 如果表达产物带有组氨酸标签,继续方案 7



        来源:丁香实验

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