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        用亚氨基二乙酸(铁螯合)Sepharose6B 分离磷酸肽实验

        相关实验:用亚氨基二乙酸(铁螯合)Sepharose6B 分离磷酸肽实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        Sepharose 6B 柱(1x6 cm;~5 ml), 含亚氨基二乙酸(铁螯合),(柱的理论容量为~2umol 的磷蛋白)(Pharmacia Biotech Inc.)

        Tris-HCl(50 mmoI/L;pH7.6), 含 EDTA(100 mmol/L) 和 NaCl(500 mmol/L)

        氯化铁(50 mmol/L)

        乙酸(0.1mol/L)

        乙酸钠(0.1mol/L,pH 5.0)(即,0.1mol/L 乙酸用 NaOH 调 pH 至 5.0)

        乙酸铵(1%;PH6.3 和 pH8.3)

        SpeedVac 型旋转浓缩器(Savant Instruments,Inc.)

        EDTA(0.2mol/L;pH8.0)

        操作程序

        全部操作均在室温下进行。

        1) 用 4 体积(20 ml) 洗亚氨基二乙酸 Sepharose 6B 柱。

        2) 用 4 体积含 100 mmol/L EDTA 和 500 mmol/L NaCl 的 50 mmol/L Tris-HCl(pH7.6) 洗柱。

        3) 用 4 体积 H2O 洗柱。

        4) 用 4 体积 50 mmol/L 氯化铁洗柱,以用铁饱和柱子。

        5) 用 2 体积(10 ml)0.1mol/L 乙酸洗柱,去除疏松结合的铁。

        6) 加肽混合物(溶于~4 ml 0.1mol/L 乙酸)于柱上。

        7) 用 2 体积的 0.1mol/L 乙酸洗柱,去除未结合的肽。

        8) 用 2 体积 0.1 ml/L 乙酸钠 (pH5.0) 洗柱。

        9) 用 3 体积 (15 ml)1% 乙酸铵 (pH6.3) 洗柱。

        10) 用 4 体积 1% 乙酸铵 (PH8.3) 洗脱磷酸肽。

        11) 分部收集 0.5~1.0-ml样品。按 pH(点 pH 试纸测定之)合并样品。用 SpeedVac 型旋转浓缩器浓缩,分析磷酸肽。

        12) 洗脱后,立即用 4 体积的 0.2mol/L EDTA 洗柱。无金属螯合的柱子可在室温下保存于 0.2mol/L EDTA(pH8.0) 中,并可重复使用多次。

        来源:丁香实验

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