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        胰岛素受体的溶解及活性测定实验

        相关实验:胰岛素受体的溶解及活性测定实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        纯化的鼠肝质膜(得自实验 1)

        Ti 70 转头和带盖的聚丙烯离心管

        牛血清白蛋白(BSA,1%)

        [125I] 胰岛素(受体级,DuPont NEN NEX 196)

        猪胰岛素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml), 于 0.001mol/LHCl 中〕(Sigma Chemical Co.I3505)

        牛γ-球蛋白(0.4%,于溶液 B)(Miles Laboratories Co.82-041-2)

        聚乙二醇 6000(20% 水溶液)

        试剂

        溶液 B

        溶液 C

        结合缓冲液(溶解受体用)

        (配方,见"试剂的配制" PP.234~240)

        操作程序

        用 TritonX-100 溶解胰岛素受体

        比较 TritonX-100 与其他去垢剂从鼠肝质膜上溶解胰岛素受体的效率,其结果见表 4-3。

        胰岛素受体的溶解及活性测定实验

        1)取 100~150 mg 纯的鼠肝质膜,与 10 ml 溶液 B 混合,再加 4 ml 溶液 4℃孵育 30 min。

        2) 悬液 200000 g(Ti 70 转头,45000r/min) 离心 30 min, 用巴氏吸管收集上清,注意不要搅动沉淀。
        注: 常存在 TritonX-100 不溶的沉淀物,紧粘于管底。

        胰岛素对溶解受体结合活性的测定

        1) 于微量离心管中建立如下反应体系:

        胰岛素受体的溶解及活性测定实验

        从 A 管得出总的结合量,从 B 管得出非特异结合量。

                                                            特异结合量=总结合量-非特异结合量。

        注:受体纯的 [125I] 胰岛索(NEX 196) 购自 DuPont NEN 公司,比放射性强度为 2200uCi/nmol。胰岛素浓度为 35.5nmol/L。在本试验中,必须用结合缓冲液将 [125I] 胰岛素储液稀释至 5nmol/L。在溶解受体的受体结合试验中需 [125I] 胰岛素的终浓度为 500pmol/L,相当于 300-ul 反应体系中加入 30ul 5nmol/L 的溶液。

        2) 反应体系在 44℃ 孵育16 h, 或室温孵育 2 h。

        3) 沉淀,将受体结合的胰岛素与游离胰岛素分开。加入 75ul 含 0.4% 牛γ-球蛋白的溶液 B,44℃ 孵育 5 min。再加 375ul 20% 聚乙二醇 6000, 44℃ 孵育 10 min。混合物于微型离心机中离心 10 min, 收集沉淀。尽量除尽各管上清,计数沉淀的放射性强度。

        注:在纯化过程中,虽常用聚乙二醇沉淀法测定胰岛索受体数,但此法多半会低估结合位点的绝对数,因为沉淀的只是胰岛素-受体复合物的一部分(Finn 等,1984)。为测定胰岛素对其受体的亲和性,要加入几种不同浓度的未标记胰岛素. 使胰岛索终浓度为 500pmol/L 至 200nmol/L,如本单元实验 1 所述。

        来源:丁香实验

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