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        透析得可溶的重折叠σ32 单体实验

        相关实验:透析得可溶的重折叠 σ32 单体实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        CentriconTM-10 型离心浓缩器(Amicon,Inc.)

        大小排阻髙效液相色谱柱 TSK-GEL G3000 PWXL(7.8x300 mm)(TosoHaas)

        50 mmol/L Tris(pH7.9)+200 mmol/LNaCl

        操作程序

        用大小排阻 HPLC 色谱检测可溶性单体的形成

        1)在拟试的条件下透析样品。

        2)从透析袋中取出样品,13000r/min 离心 10 min, 使澄清。保留上清。

        3) 若透析时样品的蛋白浓度太低,则可用 Cenricon-10 型离心浓缩器浓缩。于 Centricon-10 管中加 2.0 ml 透析样品,13000r/min 离心 90 min, 或至体积减至原体积的 1/5~1/10。
        注:需要选择某一孔径大小的 Centricon 管,以使水和盐能在离心力作用下透过膜而把σ32 保留下来。Centricon-30 和 Centrioon-100 管的孔径较大,浓缩也较快,但本实验采用 Centricon-10 管,其标称截留分子量为 10000Da, 这是因为σ32 的分子量是 32000Da 而有些σ32 会通过较大的孔透出。Centricon 管也可用来改变样品的盐浓度。可简单地将样品浓缩 10 倍,再用另一种缓冲液将其恢复至原体积。能处理更小(0.5 ml;Micrecon 型)和更大(20 ml;Centriprep 型)体积的浓缩器也均可从 Amicon 公司买到。

        4) 给大小排阻色谱柱 TSK-GELG3000PWXL(7.8x300 mm) 进样 100~400ul 上清,该柱事先用 50 mmol/L Tris(pH7.9)+200 mmol/LNaCl 在 1 ml/min 流速下平衡,并在相同条件下洗脱,分部收集 0.5-ml 组分,计 30 min。
        注:加盐是为了防止蛋白质与聚合物基质的弱离子结合,这种结合作用会使洗脱时间失真,妨碍大小排阻色谱分析正常进行。

        5) 用紫外检測器于 280mn 检测柱的流出液,估算作为可溶性单体而流出的物料的比例。
        注:应先标定 HPIX 的大小排阻色谱柱,方法是用一组已知分子量的蛋白质在相同洗脱条件下过柱分析。再以分子量标准参照物的出峰时间对其分子量的对数作图,用插入法即可求出分析σ32 透析样品时所洗联的那种蛋白质的分子量。

        6) 如必要,用 SDS-PAGE 电泳分析所选的组分,以证实洗脱峰的一致性。

        来源:丁香实验

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