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        DNA 酶 I 足迹探针的制备实验

        相关实验:DNA 酶 I 足迹探针的制备实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料与设备

        质粒 DNA(含待分离序列特异性 DNA 结合因子的识别位点)

        合适的限制酶

        粉/氯仿(1:1;v/v)

        氯仿/异戊醇(3-甲基-1-丁醇)(24:1;v/v)

        乙醇(100% 和 75%;v/v)

        牛肠碱性磷酸酶(BoehringtrMannheimCorp.713023)

        [γ-32P]ATP(150uCi/ul;7000Ci/mmol;21pmol/ul)

        T4 多核苷酸激酶(10U/ul)(Stratagene)

        乙酸铵 (2.5mol/L)

        乙酸钠 (3mol/L)

        SpeedVac 旋转浓缩器(Savant Instruments,Inc.)

        丙烯酰胺

        双丙烯酰胺

        过硫酸铵

        TEMED(N,N,N',N'-四甲基乙二胺)

        试剂

        TE

        牛肠碱性磷酸酶缓冲液(10x)

        T4 多核苷酸激酶缓冲液(10x)

        TBE 加样缓冲液(5X)

        TBE(10x)

        (配方,见“试剂的配制” pp.131~138.)

        操作程序

        质粒 DNA

        用于制备 DNA 酶 I 足迹探针的质粒 DNA 必须是高质量的(CsCl 纯化的),其 RNA 杂质的含量必须很低。RNA 杂质会抑制激酶的反应。我们一般采用连续两步 CsCl 梯度法纯化 DNA。

        第一次限制酶切消化

        第一次限制酶切消化的目的是形成 5'突出端。酶切位点的位置应在离因子结合位点 50~200bp 范围内。

        1) 质粒 DNA(50ug 的量较方便) 与第一个限制酶一起孵育,用琼脂糖凝胶电泳监测反应是否完全。

        2)DNA 用 1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。

        3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解,至终浓度为 1ug/ul。

        去除 5'端的嫌酸

        1) 每微克 DNA 中加入 1U 牛肠碱性磷酸酶 [例如,为使 50ugDNA 脱磷酸, 需在 500ul 总体积中加入 50U 磷酸酶(50U=50ul)〕。37°C 孵育 2 h。

        2)DNA 用酚、1:1 酚/氯仿和 24:1 氯仿/异戊醇各抽提一次。

        3) 乙醇沉淀 DNA,TE 溶解,至终浓度为 1ug/ul
        注;一个便利的办法是将大量 (≥50ug)DNA 酶切消化和脱磷酸后作为储液储存起来,需要时标记少量 (一般为 5ug)DNA 备用。

        标记 5'端

        1) 于含 2ul 10xT4 多核苷酸激酶缓冲液的 11ul 水溶液中加入 5ul 经酶切消化和脱磷酸的 DNA(1ug/ul; 总量 5ug;5pmol5'端),震荡混合。

        2) 对此混合物,加入 1ul[γ-32P]ATP(标记 ATP 与 DNA5'端的摩尔比应为 2~4),然后加入 1ul T4 多核苷酸激酶(此激酶是过量的),反应终体积为 20ul。

        3)37°C 孵育 1~2 h。

        4) 加 200ul 2.5 ml/L 乙酸铵,震荡混合。微型离心机离心 0.5s, 使溶液回到离心管底部。

        5)70°C 加热 15 min, 使激酶失活。置冰上冷却。

        6) 加 660ul 100% 乙醇,颠倒混合 a 微型离心机离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
        注:应极小心,不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。

        7) 加 100ul TE, 震荡混合,溶解 DNA。

        8) 加 100ul 1:1 酚/氯仿,震荡混合 1 min, 离心 5 min, 使分相。

        9) 将上层转移至一新管,加入 10ul 3 ml/L 乙酸钠,震荡混合。

        10) 加 300ul 100% 乙醇,颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
        注:应极小心,不要吸走 DNA 沉淀。并确认沉淀有适量水平的放射性。

        11) 加 800ul 75% 乙醇,颠倒混合。离心 15 min, 沉淀 DNA。用吸头吸去上清。
        注:应极小心,不要吸走 DNA 沉淀,并确认沉淀有适量水平的放射性。

        12) 用 SpeedVac 旋转浓缩器干燥沉淀。

        13)DNA 溶于 10ulTE。

        第二次限制酶切消化

        第二次限制酶切消化的目的是产生 200~800bp 的标记 DNA 片段。

        1) 探针 DNA 与第二种限制酶孵育。为保证此反应进行完全,建议尽可能地使用大大过量的酶,如対 5~10ug 的 DNA 甲 50~100U 的限制酶。
        注:应注意限制酶的磷酸酶活性。通常用廉价的酶如 EcoRⅠ和 HindⅢ较合适。反应 80ul体积中进行较为方便。如需要,可用琼脂糖凝胶电泳监测反应的进程。

        2) 用 1:1 酚/氯仿抽提 DNA。然后于 80ulDNA 中加入 20ul5xTBE 加样缓冲液,直接加样至 5% 聚丙烯酰胺(非变性) 凝胶。

        标记限制酶切片段的聚丙烯酰胺凝胶电泳

        1) 按下列配方制备聚丙级酰胺凝胶 (20 cmX40 cmX1.5 mm; 有 4 个 3-cm 加样孔):

        丙稀酰胺 (30%;w/v)/双丙插醜胺 (0.8%;w/v)20.3 ml

        TBE(10x)12.5 ml

        H2092.2 ml

        混合后过滤,然后加 750ul 10%(w/v) 过硫酸铵和 60ul TEMED。

        2) 凝胶至少聚合 45 min,然后在 19W(约 400V) 下预电泳至少 lh。电泳时胶不应变热。

        3) 加样,电泳一段所需时间后. 电压会缓慢地从 400V 增至 450~500V。
        注:二甲苯腈蓝在 5% 胶上与 300-bp 限制酶切片段一起迁移。

        从聚丙烯酰胺凝胶洗脱 DNA
        本法用于≤8% 的聚丙烯酰胺凝胶,效果良好

        1) 从胶板上切下有放射性的条带,应尽量减小条带的大小。

        2) 用 18-G 号针(粉红色)在 l.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。

        3) 将有孔的微量离心管底部插入另一 1.5-ml 微量离心管(无孔)中。

        4) 将切下的胶块放入上一个有孔的微量离心管中。

        5) 将两个微量离心管一起放在微型离心机中离心 15s。胶块通过小孔进入下一个微量离心管时应被破碎。

        6) 加 300ul TE, 震荡混合。

        7)37°C 孵育过夜。

        8) 用 20-G 号针(黄色)在 1.5-ml 塑料微量离心管底打一小孔。在管底小孔之上填装约 200ul(装填结实后的体积) 硅化玻璃棉。硅化玻璃棉应装填结实于管底。然后,将此管的底部插入另一 1.5-ml微量离心管(无孔)中。用一尖端被刀片切去大约 2~3 mm 的 1000-ul 吸头(蓝色),将 TE 和破碎胶块的混合物置于玻璃棉上,将这两个微量离心管制成的装置放在微型离心机中离心 10s。下管中应含有 TE 洗脱的 DNA 片段。

        9) 乙醇沉淀探针 DNA, 然后溶于 TE。

        10)-20°C 保存。

        来源:丁香实验

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