凝胶迁移率变动分析实验

材料

丙烯酰胺

双丙烯酰胺

过硫酸铵（10%;w/v)

TEMED(N,N,N',N', 四甲基乙二胺）

甘油 (50%;v/v)

竞争 DNA(溶于 TE)(竞争 DNA 的种类和用量可随蛋白质种类和纯度的不同而异;亲和层析纯化的蛋白质不用竞争 DNA)

迁移率变动分析探针 (由互补寡核苷酸经 T4 多核苷酸酶和 [γ-³²P]ATP 的磷酸化后制成）

试剂

TBE(10X)

凝胶迁移率变动分析缓冲液 (10x)

TE

(配方，见"试剂的配制"，pp.131~138)

操作程序

1) 按下列配方制备一块 5% 聚丙烯酰胺凝胶 (20 cmx20 cmx1.5 mm):

丙烯酰胺 (30%;w/v)/双丙烯酰胺 (0.8%;w/v)                 16.2 ml

TBE(1x)                                                                          5.0 ml

H₂0                                                                               78.8 ml

混合，0.45um 滤膜过滤，然后加入 600ul10%(w/v) 过硫酸铵和 48ulTEMED。

2) 凝胶聚合 30~60 min, 上样前用 100V 电压预电泳 30 min。

3) 对每个样品，均将下列成分混合于一置冰上的反应管：

迁移率变动分析缓冲液 (10x)                                            1ul

甘油 (50%;v/v)                                                                   2ul

竞争 DNA(需要时加; 对于纯的蛋白质，可加 1ulH₂0 代替)1ul

蛋白质组分 (溶于含 0.1mol/LKCl 的缓冲液 Z 中)               5ul

迁移率变动分析探针 (~20000cpm/ul)                               1ul

总体积：10ul

轻弹反应管使温和混合。

4) 样品在室温下孵育 10~15 min

5) 样品直接加样上胶。因染料常常会抑制蛋白质与 DNA 的结合，故建议不要在样品中加染料。

6) 室温下，以 100V 电压电泳，直至作为参照染料溴酚蓝 (点在胶板上不含蛋白质的泳道上) 迁移至胶板下方约 10 cm 止。

7) 胶干燥后进行放射自显影 (一般，-80°C 数小时或过夜）。