• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        诱变 PCR 实验

        相关实验:诱变 PCR 实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        氯仿/异戊醇(24:1,体积比)

        乙醇,100%

        矿物油或者一个蜡珠

        3mol/L NaOAc,pH5.2

        5 mmol/L MnCl2

        1X 突变 PCR 缓冲液

        70 mmol/L MgCl2

        500 mmol/L KCl

        100 mmol/L Tris-HCl,25°C 时 pH8.3

        1g/L 明胶

        2. 酶和酶缓冲液

        DNA 聚合酶

        Native Taq 或 AmpliTaq DNA 聚合酶(Applied Biosystems 或者其他有执照的供应商不要用其他热稳定 DNA 聚合酶替代

        3. 核酸和寡核苷酸

        高纯度的脱氧核苷 5'-三磷酸(Pharmacia,USB/Amersham)

        10XdNTP 混合物,包含 2 mmol/LdGTP、2 mmol/LdATP、10 mmol/LdCTP 和10mmol/LdTTP

        模板 DNA

        引物

        4. 凝胶

        琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色

        5. 特殊设备

        热循环仪

        二、方法

        1. 准备 10X 突变 PCR 缓冲液。

        2. 准备10XdNTP 混合物。

        3. 准备一个 5 mmol/LMnCl2 溶液,不要与 10XPCR 缓冲液混合,否则将产生沉淀干扰 PCR 的扩增。

        4. 将 10ul 10X 突变 PCR 缓冲液、10ul lOXdNTP 混合物、每种引物各 30pmol 以及20fmol 模板 DNA 混合在一起,用 H20 将总体积补齐至 88ul,然后混匀。

        5. 添加 10ul 5 mmol/L MnCl2 溶液,充分泥匀确保没有沉淀形成。

        6. 添加 5U(2ul)Taq DNA 聚合酶,将最终体积定为 100ul, 轻轻混匀。如果需要的话,可以覆盖矿物油或一个蜡珠。

        7. 以 94°C 1 min、45°C1 min、72°C lmin 温育 30 个循环。不要设定热启动步骤,也不要在最后一个循环的末尾设定延长的延伸时间。

        8. 纯化反应产物,首先用氯仿/异戊醇(24:1, 体积比)抽提,随后用 0.25mol/LNaOAc 和 2.5 倍 100% 乙醇沉淀。

        9. 将一小部分纯化的产物在琼脂糖凝胶中检测,经溴化乙锭染色后确认全长的产物的量是否令人满意。突变 PCR 应该与标准 PCR 平行进行(忽略上面所列的 4 点不同这两种 PCR 所得到的全长 DNA 的量应该相差不多。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序