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细菌抗利福平紫外诱变实验

互联网2013-11-13

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实验原理

微生物育种的目的就是要人为地使某些代谢产物过量积累,把生物合成的代谢途径朝人们所希望的方向加以引导,或者促使细胞内发生基因的重新组合优化遗传性状,获得所需要的高产、优质和低耗的菌种。诱变和筛选则是微生物育种的两个主要环节。

育种可分为自发性突变育种和诱发突变育种。但是自发突变的频率很低，一般在 10 -6 ~10 -10 ，而诱变育种频率较高。诱变育种就是利用物理和化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，大幅度提高突变频率，然后设法采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选少数符合育种目的的突变株。诱变育种除能提高产量外，还可达到改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺等目的，是目前最广泛使用的育种手段。

诱变育种主要通过物理诱变剂（如：紫外线、X-射线、γ-射线、快中子、激光、超声波等）和化学诱变剂（如亚硝酸、硫酸二乙酯、亚硝基胍、吖啶类染料等）处理微生物群体细胞，通过合理的筛选程序和方法，从中选出遗传物质分子结构发生改变的少数细胞。常利用形态突变型、生化突变型、条件致死突变型和致死突变型进行初筛而获得优良性状的突变株。诱变育种方法简便，容易掌握，仍是目前行之有效的一种重要育种手段，但自觉性、方向性差。

物理诱变因子中以紫外线辐射的使用最为普遍，其他物理诱变因子则受设备条件的限制，难以普及。一般用于诱变育种的物理因子有快中子、60Co、γ-射线和高能电子流β-射线等。紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史，尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种，但到目前为止，对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中，有80%左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的。因此，对于微生物菌种选育工作者来说，紫外线作为诱变因子还是应该首先考虑的。

紫外线可以引起的 DNA 损伤，可使同链 DNA 的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而可能引起突变或死亡。

在所有传统的物理诱手段中，紫外线诱变由于有设备简单，诱变效率高,操作安全简便等特点而被广泛应用。经大量实验证明利用紫外诱变的方法能选育出大量产量高，活性强的优良微生物菌种。本实验将利用紫外诱变法，筛选出利福平抗性更高的菌株。

利福平可能是由于和起始的嘌呤核苷5`-三磷酸（pppG或pppA）竞争与酶结合部位，因而干扰RNA链的第一个磷酸二酯键的形成，其作用位点可能在RNA聚合酶的β-亚基上，所以高剂量抗药性突变株的产生可能由于其RNA聚合酶β-亚基构象上的变化。

诱发突变育种路线

实验试剂

利福平溶液(1mg/ml) 无菌水 70％乙醇

牛肉膏蛋白胨培养基(肉汤培养基液/固)

实验设备

恒温培养摇床
超净工作台
磁力搅拌器(配有磁力搅拌子)
混旋仪
手提式灭菌锅
恒温培养箱
无菌试管
无菌移液管
滤器
0.22μm的微孔滤膜
一次性注射器
试管架
接种环
玻璃涂棒等

实验材料

抗药菌株：细菌CT（抗药剂量：50μg/ml）

实验步骤

1. 紫外线诱变

（1）制备菌液

将9ml无菌水倒入培养细菌CT(50μg/ml)斜面内，灭菌接种环刮下斜面上的菌苔，并用混旋仪震荡均匀。从管中吸取1ml菌悬液，梯度稀释到10^-3 (根据经验，此稀释度的细菌悬液内含有10⁷ -10⁸ /ml细胞)。充分混匀10^-3 菌液后，吸取5ml菌液于装有磁力搅拌子的培养皿（直径9cm）内，共两皿。

（2）紫外线照射

预热紫外灯30min后，将培养皿放在磁力搅拌器上，打开皿盖，扣置在工作台面上，开启磁力搅拌器和紫外灯，同时计时，一皿1min，另一皿2min。照射完毕，分别吸取0.2ml菌液于含50ml肉汤培养液的锥形瓶内混匀，避光摇瓶培养24小时（30℃，220r/min）。

2. 突变株筛选

（1）制备滤器和利福平过滤除菌

蒸馏水浸泡0.22μm微孔滤膜后置于滤器中，测试滤器的气密性。灭菌后用滤器过滤利福平于无菌器皿中备用。

（2）制备梯度平板、涂布菌液

取利福平1ml于培养皿中，加入10ml预融化肉汤固培（斜放），凝固后再注入10ml预融化肉汤固培（平放），得到利福平梯度平板。

取诱变菌液0.2ml于利福平梯度平板上，无菌涂棒涂匀， 37℃培养24～36h。将高药物浓度一边的稀疏菌落接种至肉汤斜面上保存备用(每皿8～10个菌落，保存8～10个菌种)。

利福平梯度平板制备方法及菌落形态

3. 抗药性测定

（1）制备不同浓度的药物平板

分别取除菌利福平0.6、0.75、0.9、1.2、1.5ml加入培养皿中（每个浓度2皿共10皿），加入预融化肉汤固培15ml，混匀凝固后即成为40、50、60、80、100μg/ml药物平板。

（2）抗药性测定

将上述各皿底的外面用记号笔画成10等份，编号后将若干抗药菌株逐个连续划线于上述5种浓度的药物平板上，倒置37℃培养过夜。次日观察各菌株的生长情况，并记录结果。

8等份平板划线

注意事项

这个实验的成败关键在于：

1. 磁力搅拌子放入培养皿之前要在超净工作台内用70％乙醇灭菌，并用无菌水洗涤，自然干燥；否则涂布时会有很多杂菌污染；

2. 滤器使用前一定要检查气密性，针筒活塞下压并能自动弹回恢复，则气密性良好；否则利福平过滤除菌不完全会有杂菌污染；

3. 制备梯度平板时，注意皿底作一个记号“↑”，以表示药物浓度从高到低，以便于移种抗药性菌株；

4. 由于经紫外线损伤的DNA能被可见光复活，因此诱变处理后的菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，避光摇瓶培养。

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