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        用 PCR 分析连接反应的底物和产物

        相关实验:用 PCR 分析连接反应的底物和产物

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        ddH2O

        2. 酶和酶缓冲液

        10X Vent 缓冲液

        Vent DNA 聚合酶

        3. 核酸和寡核苷酸

        dNTP,各 20 mmol/L

        引物,可以与合成的 DNA 文库克隆位点两侧的载体序列退火

        质粒 DNA(见下面第 1 步)

        4. 特殊设备

        琼脂糖凝胶电泳所需的试剂和设备,包括溴化乙锭

        热循环仪

        二、方法

        1.混合以下组分。

        10~50ng 的质粒 DNA

        50pmol 的各引物

        5ul 的 10X Vent 缓冲液

        dATP、dCTP、dTTP 和 dGTP, 各 0.5ul

        1U 的 Vent DNA 聚合酶

        用 ddH20 定容至 50ul

        下面的每种质粒载体,应该分别进行反应:

        未消化载体

        消化载体,但没连接

        消化载体,并在无文库 DNA 情况下进行连接

        消化载体,并用文库 DNA 进行连接

        2.在一个热循环仪中,94°C 将混合物预热 20s。

        3.按下面的参数进行 30 轮 PCR 循环。

        94°C10s

        55°C10s(或用引物的合适退火温度)

        72°C15s

        将最后一个循环的延伸时间延长至 30s

        4.冷却至 4°C

        5.取 25ul 的各反应产物,跑 4% 的琼脂糖凝胶电泳,并用溴化乙锭染色分析(Sam-brook and Russell 2001)。

        三、分析

        在图 26-3 所示的例子中,在连接之前进行线性化载体的 PCR 分析,显示载体是完全线性化的,因为没有得到起始载体对应的 PCR 产物(图 26-3, 第 4 泳道)。若不存在文库插入片段,连接载体的 PCR 结果显示发生了一定量的自连(图 26-3, 第 2 泳道),并显示存在一小部分的单切载体。然而,当载体与文库插入片段进行连接后,大部分的 DNA 产物与正确连接的文库 DNA 相对应,而没有与起始载体对应的 PCR 产物(图 26-3, 第 3 泳道)。当载体与插入片段连接后,检测不到起始载体对应的 PCR 产物,但仅用载体连接后能检测到 (比较图 26-3 第 2 泳道和第 3 泳道),可以解释为文库 DNA 连接到了单切的载体上。这一副产物不会形成封闭的环状质粒,不能被克隆,也不会产生 PCR 产物。

        用 PCR 分析连接反应的底物和产物

        在这个例子中,PCR 作为一种重要的分析工具,能够很可靠地验证限制性酶切反应和连接反应。因此,研究者可以用正确的 DNA 进行文库构建的后续步骤,更可能最终获得高质量的文库。通过转化和扩增细菌,可以获得最终的文库,再用标准的程序对质粒 DNA 进行纯化(Sam brook and Russell 2001)。

        来源:丁香实验

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