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        差异 DNA 的 PCR 扩增实验

        相关实验:差异 DNA 的 PCR 扩增实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        dNTP 溶液(包含所有 4 种 dNTP,各 10 mmol/L)

        2. 酶和酶缓冲液

        PCR 反应缓冲液,10X

        聚合酶混合液,50X(Advantage2,Clontech,或相当产品)

        3. 核酸和寡核苷酸

        DNA 样品(即方案 2 第 16 步中的各消减样品)

        嵌套 PCR 引物 NP1(10umol/L)

        嵌套 PCR 引物 NP2R(10umol/L)

        PCR 引物 PI(10umol/L)

        来自方案 1 第 4 阶段第 8 步的未消减检测者对照

        4. 专用设备

        热循环仪,预设至 72°C

        5. 附加试剂

        2% 琼脂糖凝胶电泳所需的试剂与设备

        二、方法

        1. 初级 PCR

        (1)每个稀释的 DNA 样品(即方案 2 第 16 步中的各消减样品,以及方案 1 第 4 阶段第 7步中相应的稀释但未消减的检测者对照),各取 1ul分装到准确标记的离心管中。冷冻的样品应该解冻,并在 72°C 温育,然后吹吸混匀再使用。

        (2)另取一个离心管,为所有的初级 PCR 管配制一个主体混合液。按照下面的顺序将试剂混合。

        灭菌水                                     19.5ul
        PCR 反应缓冲液,10X            2.5ul
        dNTP 溶液(10mmol/L)           0.5ul
        PCR 引物 PI(10pmol/L)           1.0ul
        50X 聚合酶混合液                   0.5ul
        总体积                                     24.0ul

        (3)取 24ul 主体混合液,分装到第 1 步准备的各反应管中。

        (4)用 1 滴矿物油覆盖。

        (5)在热循环仪中,将反应混合液 74°C 温育 5 min,以延伸接头。这一步「填充」接头所缺失的链,因而产生了 PCR 引物的结合位点。不要将样品从热循环仪中取出。

        (6)立即开始下面的循环。

        差异 DNA 的 PCR 扩增实验

        (7)从每个管中取 4ul, 在 2.0% 琼脂糖 TAE 凝胶上分析。
        对于某些复杂的消减(复杂的组织或其核基因钽),建议分两步进行初级 PCR, 这样可以显著降低背景。首先,进行本方案所描述的初级 PCR, 然后按照方案 4 第 1 阶段笫 10 步所描述的步骤再进行一次初级PCR。最后再逬入次级 PCR(方案 3)。

        2. 次级 PCR

        (8)每个初级 PCR 产物各取 2ul, 用 38ul 水稀释。

        (9)从第 1 步稀释的各初级 PCR 产物中,各取 lul,加到标记好的离心管中。

        (10)按照下面的顺序将试剂混合,为次级 PCR 及一个附加反应的样品配制主体混合液。

        灭菌水                                            18.54ul
        PCR 反应缓冲液,10X                    2.5ul
        嵌套 PCR 引物 NH(10umol/L)         1.0ul
        嵌套 PCR 引物 NP2R(10umol/L)     1.0ul
        dNTP 溶液(10 mmol/L)                 0.5ul
        50X 聚合酶混合液                           0.5ul
        总体积                                             24.0ul

        (11)将 24ul 主体混合液分装至第 2 步的各反应管中。

        (12)用 1 滴矿物油穎盖。

        (13)立即开始下面的循环。

        差异 DNA 的 PCR 扩增实验

        (14)从每个管中取 4ul,在 2.0% 琼脂糖 TAE 凝胶上分析。

        (15)反应产物应保存在- 20°C。现在,这个 PCR 产物就富集了差异 DNA。

        如果不需要 MOS, 就可以直接进入「消减 DNA 的克隆」这一部分。

        来源:丁香实验

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