高质量 DNA 的纯化实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

EDTA，100 mmol/L

异丙醇

裂解缓冲液

10 mmol/LTris-HCl

1mmol/LEDTA

150 mmol/LNaCl

0.5%SDS,pH10.5

NaCl，0.15mol/L 和 6mol/L

细胞核裂解缓冲液

75 mmol/LNaCl

24 mmol/LEDTA,pH8.0

蛋白酶 K 或者链霉蛋白酶，20 mg/ml。

SDS,200 g/L

蔗糖，lmol/L

Tris-HCl,2mol/L,pH9.2

Triton 裂解缓冲液

10mmol/LTris-HCl

5 mmol/L,MgCl2

1%TritonX-100

TE 缓冲液（lOmmol/LTris-HCl,lmmol/LEDTA,pH7.5)

蔗糖，pH9.2

TritonX-100

2. 专用设备

水浴，预热到 55°C

破璃棒

3. 细胞和组织

处理过的乳腺瘤组织（100 mg 组织用于激素受体分析）或者用 PBS 洗过 2 次的 5X105培养细胞。

二、方法

1. 向盛有细胞的 l0 ml 管中，加入 750ul 裂解缓冲液和 200ug 蛋白酶 K(或者链霉蛋酶);55°C 保温至少 90 min, 直到沉淀溶解。

2. 如果沉淀不容解，重复步骤 1。

3. 加入 250ul 6mol/LNaCl, 小心地摇动。

4.4°C 离心（3000r/min)15 min。小心将上清液转移到另一新管中。

5. 重复步骤 3 和 4。

6. 加入等体积的异丙醇，颠倒离心管直到看见 DNA。将 DNA 缠绕到玻璃棒上，沿管壁轻轻地将 DNA 拉出，将其转移到 300ul 的 TE 或者灭菌双蒸水中。

7. 放于 4°C，使其溶解。

从 10 ml 血液中提取 DNA

8. 加入 40 ml 预冷的（4°C)Triton 裂解缓冲液。

9.4°C 放置 30 min; 每隔几分钟将管子翻转一下。

10.4°C 离心（3000r/min)30 min，弃上清液。

11. 用 5~15 ml0.9%(0.15mol/L) 的 NaCl 洗沉淀（细胞核）。

12.2300r/min 离心 10min。

13. 弃上清液。细胞核可以保存在-20°C。

14. 加入 3 ml 细胞核裂解缓冲液，摇匀。

15. 加入 25ul 链霉蛋白酶（20 mg/ml) 和 230ul10%SDS，室温振摇过夜。

16. 加入 1ml6mol/L 的 NaCl，摇勾。

17.4°C 离心（3000r/min)15 min，小心将上清液转移到另一新管中。

18. 重复步骤 10。

19. 加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管直到看见 DNA。将 DNA 缠绕到玻璃棒上，沿着管壁轻轻地将 DNA 拉出，将其转移到 400ul 的 TE 或者灭菌双蒸水中。

20. 放于 4°C, 使其溶解。