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        竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

        相关实验:竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        第一部分:单链 cDNA 的合成

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        去除 RNA 酶的双蒸水

        10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

        2. 酶和酶缓冲液

        MMLV 逆转录酶(100~200U/ul)

        SUPERaseIN(20U/ul,Ambion)

        3. 核酸和寡核苷酸

        dNTP 混合物(10 mmol/L, 包含所有四种 dNTP)

        随机引物(50umol/L)

        总 RNA(1~5ug)

        4. 放射性复合物

        竞争性 RNA 转录本,109 拷贝(见方案 4)

        5. 实验器材

        薄壁的 PCR 管

        二、方法

        1. 在冰上向薄壁的 PCR 管中加 2ul 的 50umol/L 随机引物,一管用于 RNA 样品,一管用于竞争性 RNA 转录本。

        2. 加 1~5ug 总 RNA 到样品管(最大体积为 10ul)。

        3. 加 109 个拷贝的竞争性 RNA 转录本到相应管中(最大体积为 10ul)。

        4. 在每管中加入 4ul 的10mmol/LdNTP 混合物。

        5. 用去除 RNA 酶的双蒸水把体积增加到 16ul。

        6.70°C 加热 10min,变性二级结构,然后立即放在冰上。

        7. 加 2ul 的 10XRT-PCR 缓冲液。

        8. 加 1ul 的 20U/ulSUPERaseIN。

        9. 加 1ul 的 100~200U/ulMMLV 逆转录酶。

        10.42°C 孵育 lh。

        11.95°C 加热 10min 使逆转录踌失活。

        12. 继续进行扩增反应,或-20°C 储存。

        第二部分:PCR 扩增

        这一方案中 PCR 扩增的宗旨与相对 RT-PCR 中描绘的相同(见方案 1)。方案设计包括6 个反应及额外的 10% 份额。这对于一个样品用 4 个稀释浓度的竞争子、1 个无竞争子的对照和 1 个无模板的对照是足够量的。

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        去除 RNA 酶的双蒸水

        10XRT-PCR 缓冲液(100 mmol/LTris-HCl、pH8.3,500 mmol/LKC1,15 mmol/LMgCl2)

        2. 酶和酶缓冲液

        TaqDNA 聚合酶(5U/pl)

        3. 核酸和寡核苷酸

        dNTP 混合物(10 mmol/L,包含所有四种 dNTP)

        基因特异的正向引物(5umol/L)

        基因特异的反向引物(5umol/L)

        来自上述反转录反应的 cDNA

        4. 放射性复合物

        竞争性 RNA 反转录反应物(未稀释=5X107 拷贝/ul)

        薄壁的 PCR 管

        6. 专用仪器

        可编程的 PCR 仪

        二、方法

        1.准备 PCR 反应混合物。

        10XRT-PCR 缓冲液 35ul

        10 mmol/LdNTP 混合物 28ul

        5umol/L 基因特异的正向引物 14ul

        5umol/L 基因特异的反向引物 14ul

        5U/ulTaq DNA 聚合酶 1.75ul

        去除 RNA 酶的双蒸水 236.25ul

        2.平均在每个 PCR 管中加入 47ulPCR 反应混合物,共 6 管,分别标记 1~6, 在冰上操作。

        3.加 2ul 准备好的模板 cDNA 到 1~5 号管中(见单链 cDNA 的合成)。

        4.梯度稀释的反转录反应包含的竞争性 RNA 转录本如下。

        未稀释:1ul 反转录混合物=5X107 拷贝/ul

        稀释 102 倍:加 1ul 反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X105 拷贝/ul

        稀释 104 倍:加 1ul 的稀释 102 倍反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X103/ul

        稀释 106 倍:加 lul 的稀释 104 倍反转录混合物到 99ul 的 TE 缓冲液中=5X101/ul

        5.加 1ul 未稀释的竞争子到 1 号管中,对应 5X107 拷贝/ul。

        6.加 1ul 稀释 102 的竞争子到 2 号管中,对应 5X105 拷贝/ul。

        7.加 1ul 稀释 104 的竞争子到 3 号管中,对应 5X103 拷贝/ul。

        8.加 1ul 稀释 106的竞争子到 4 号管中,对应 5Xl01 拷贝/ul。

        9.加 1ul 去除 RNA 酶的双蒸水到 5 号管中,作为无竞争子对照。

        10.加 3ul 去除 RNA 酶的双蒸水到 6 号管中,作为无模板对照。

        11.在适当的配有热盖的 PCR 仪(例如 GeneAmpPCRSystem9700,AppliedBioSystems) 上运行 PCR 扩增。扩增程序如下。

        94°C 30s

        退火温度 30s

        72°C 30s

        30 个循环

        12.在含有 1ul/ml 溴化乙锭的 2%~2.5% 的琼脂糖凝胶上检验实验结果。每个反应上样 5ul,结果以转录本的量和拷贝数来表示。由于设计时竞争子具有与目的基因同样的反应动力学,可以与目的基因共同扩增,而且在每个反应中样品和竞争子 PCR 产物的量可以直接比较。竞争子获得的 PCR 产物的强度与来自于内源 RNA 转录本的扩增相一致,同等强度代表 RNA 样品中存在的内源信息。竞争性定量 RT-PCR 实验的例子如图 13-6。

        竞争性 RT-PCR: 拷贝数的评估

        13. 为了对影响竞争子和外源转录本的反转录效率的变量进行控制,要做一个最终的RT-PCR 实验,在这个实验中样品 RNA 和竞争子 RNA 在同一个管中被反转录。使用的竞争子 RNA 的量要接近于在初始 RT-PCR 实验中所提出的量,如前所述做反转录、扩增。如前所述,与内源信息产生同样信号强度的竞争子 RNA 的量代表了样品中内源信息的量。

        来源:丁香实验

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