用RNA的免疫沉淀-rPCR方法进行体内分离核糖核蛋白复合体实验

RNA 免疫沉淀-随机聚合链反应方法可用来鉴定细胞内 RNP 复合物中的 RNA 组分。

一、材料与设备

1. 细胞提取物的制备

(1) 无菌 1X PBS。

(2) NET-2 缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl （pH 7.4），150 mmol/L NaCl，0.05% （V / V） NP-40。

(3) RNase 抑制剂。

2. 免疫沉淀

(1) 蛋白 A 琼脂糖凝胶。

(2) 载体酵母 tRNA（1 mg/ml）。

(3) RNase 抑制剂。

(4) NET-2 缓冲液。

(5) RQ1 DNA 酶（Promega 公司）。

(6) 酚：氯仿 ( 1 : 1 )，避光保存。

(7) 氯仿：异戊醇 ( 24：1 )。

(8) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )。

(9) 糖原。

(10) 无水乙醇及 80% 乙醇。

(11) DEPC 处理的水。

3. RNA-rPCR 方法

(1) M-MLV 反转录酶和反转录缓冲液：50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl₂，dNTP ( 每种 0.5 mmol/L），1 U RNase 抑制剂，50 U M-MLV 反转录酶。

(2) 通用引物-dN6：5' -GCCGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'。

(3) RNase H。

(4) 第二链 cDNA 合成：DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 大片段，10X DNA 聚合酶ⅠKlenow 大片段反应缓冲液，dNTP 混合液（每种 25 mmol/L）。

(5) 酚：氯仿（1 : 1），避光保存。

(6) 氯仿：异戊醇（24 : 1）。

(7) G-50、D-RF 无 RNA 酶离心柱（5-Prime，3-Prime 公司）。

(8) PCR 扩增体系：Taq DNA 聚合酶、10X PCR 缓冲液 [ 100 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3)，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl₂，0.1% 明胶 ] 、dNTP 混合液（每种 10 mmol/ L）。

(9) 通用引物：5'-GCCGCCGAGTGCAGAATTC-3'。

(10) DEPC 处理的水。

(11) 电泳缓冲液：1X TBE。

(12) 10X 非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液：0.25% 溴酚蓝，0.25% 二甲苯青，15%（m / V）Ficoll 400，溶于去离子水。

4. 构建 cDNA 质粒文库及转化

(1) Promega PCR 试剂盒。

(2) EcoR Ⅰ限制性内切核酸酶。

(3) pGEM-7Z 质粒载体 ( Promega 公司）。

(4) 小牛肠碱性磷酸酶及其 10X 缓冲液。

(5) 0.5 mol/L EDTA。

(6) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。

(7) 氯仿：异戊醇（24 : 1 )。

(8) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2 )。

(9) 无水乙醇和 80% 乙醇，-20℃ 储存。

(10) T4 DNA 连接酶及其 10X 缓冲液。

(11) JMJ09 感受态细菌。

(12) Falcon 2059 聚丙烯管。

(13) SOC 培养基。

(14) LB 平板培养基（100 μg/ml 氨苄青霉素）。

5. 克隆筛选

(1) TE 缓冲液：10 mmol/L Tris- HCl ( pH 7.4 )，0.1 mmol/L EDTA。

(2) PCR 反应体系，见3"RNA-rPCR 方法"。

(3) SP6 及 T7 启动子引物。

(4) 酚：氯仿（1 : 1)，避光保存。

(5) 氯仿：异戊醇(24 : 1)。

(6) 3 mol/L 乙酸钠（pH 5.2)。

(7) 非变性琼脂糖凝胶。

(8) 电泳缓冲液 1X TBE。

(9) 10X 非变性琼脂糖凝胶上样缓冲液，见3 “RNA-rPCR 方法”。

(10) fmol DNA 循环测序系统（Promega 公司）。

6. 仪器

(1) 微型凝胶水平电泳仪。

(2) 紫外透射仪。

(3) PCR 扩增仪。

(4) 高速低温离心机。

(5) 低温微型离心机。

(6) 台式低温离心机。

(7) 旋转真空浓缩仪（Speed-Vac concentrator）。

二、实验方法

1. 细胞提取物的制备

(1) 培养 3~4 瓶 150 cm² 组织培养瓶的细胞。

(2) 用 10~15 ml 冰冷的 PBS 洗三次。用细胞刮刀收集细胞，用冰冷的 PBS 重悬细胞并将其转移至 50 ml 的无菌离心管中。

(3) 于 4℃ 1000 g 离心 10 min。

(4) 用 0.5 ml 含有 100 U RNase 抑制剂的新鲜配制的 NET-2 缓冲液重悬细胞。

(5) 将细胞重悬液放置冰上超声波处理，每次 5~10 s，共三次。

(6) 将经超声波处理的细胞悬液转移至 15 ml 耐压透性玻璃管中，4℃ 10000 g 离心 10 min，回收上清液，用于免疫沉淀反应。上清液可冻存于 -80°C，但最好立即进行后续的操作。

2. 免疫沉淀

(1) 为从全细胞抽提液中去除同蛋白琼脂糖凝胶非特异件结合的成分，在总细胞蛋白有 1~1.5 mg 的细胞抽提液中加入等体积蛋白 A 琼脂糖凝胶，于 4°C 转动混合处理 30 min。

(2) 4℃ 10000 g 离心 2 min，去除蛋白 A 琼脂糖凝胶，回收上清液待用。

(3) 在处理过的细胞抽提液中加入特异性抗体，40 μl 1 mg/ml 酵母 tRNA 以及 30 μl RNase 抑制剂，于 4℃ 温育 1 h，温育时需轻柔翻转混合。

(4) 加入细胞抽提液 2 倍体积的蛋白 A 琼脂糖凝胶，轻柔混合，于 4℃ 温育 30 min。

(5) 4℃ 10000 g 离心 2~3 min，用 350 μl NET-2 缓冲液洗涤沉淀至少 4~5 次。

(6) 加入 350 μl NET-2 缓冲液及酚：氯仿（1 : 1)，剧烈漩涡振荡 1 min。

(7) 4℃ 10000 g 离心 5 min。

(8) 在水相中加入 10 U RQI DNA 酶，37℃ 温育 15 min，去除污染的 DNA。

(9) 用等体积的酚：氯仿（1：1）进行抽提。

(10) 4°C 10000 g 离心 5 min。

(11) 再用等体积的氯仿：异戊醉（24 : 1 ) 抽提水相。

(12) 4℃ 1000 g 离心 5 min。

(13) 用 0.1 体积的 3 mol/L 乙酸钠、2.5 体积乙醇及 20 μg 糖原沉淀 RNA。糖原有助于沉淀微量的核酸。样品在干冰/乙醇浴至少放置 30 min。

(14) 4°C 10000 g 离心 30 min。

(15) 弃上清液，用 80% 乙醇洗涤沉淀。

(16) 4°C 10000 g 离心 5 min。

(17) 旋转真空浓缩仪浓缩干燥，将沉淀溶于 15~20 μl 水中。RNA 可保存在 -80°C 备用。

3. RNA-rPCR 方法

(1) 取一半通过免疫沉淀制备的 RNA 样品，于 65 ℃ 加热 5 min 后迅速置于冰上冷却。

(2) 将样品进行反转录，总体积为 50 μl，反应体系为：50 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.3），10 mmol/L DTT，3 mmol/L MgCl₂，dNTP ( 每种均为 500 μmol/L)，1 U RNase 抑制剂，50 U MMLV 反转录酶，150 ng 通用引物-dN6 ( 5'-GCCGCTCGAGTGCAGAATTC- NNNNNN-3'）。

(3) 42℃ 温育 1 h，反应结束后于 95 ℃ 加热 3 min，迅速置于冰上冷却。

(4) 加入 1 μl RNase H，于 37℃ 温育 15 min，去除 RNA 链。

(5) 将样品于 95℃ 加热 3 min，置于冰上冷却。

(6) 合成 cDNA 第二条链，在 41.5 μl 第一条链合成反应产物中加入 100 ng 通用引物-dN6（5'-GC- CGCTCGAGTGCAGAATTCNNNNNN-3'），95℃ 加热 3 min，迅速置于冰上冷却。加入 5 μl 10X Klenow 反应缓冲液，1 μl dNTPs ( 每种均为 25 mmol/L)，0.5 μl 100 mmol/L DTT，1 μl（6U） Klenow 酶，终体积为 50 μl。于 37°C 温育 30 min。

(7) 先后用酚：氯仿（1 : 1 ) 及氯仿：异戊醇（24 : 1 ) 抽提样品。再用无 RNase 的 G-50，D-RF 离心柱纯化样品以除去过剩的通用引物-dN6。

(8) 取 1/10 体积的双链 cDNA 为 PCR 扩增模板，然后加入 10X PCR 缓冲液，2.5 μl dNTPs ( 每种 10 mmol/L)，100~200 ng 通用引物（5'-GCCGCTCGAGTGCAGAATTC-3' ) 及 DEPC 处理水至总体积为 50 μl，最后加入 1.5 μl Taq DNA 聚合酶。扩增条件为：94°C 1 min，55℃ 1 min，72℃ 3min，共扩增 40 个循环。

(9) 为保证合成双链 cDNA 的完整性，在 PCR 完成后再追加一个 PCR 反应。在 30 μl 的 PCR 反应液中加入 10X PCR 缓冲液、6 μl dNTP、100 ng 通用引物、3 μl Taq 酶，再加入适量的 DEPC 处理水至终体积为 300 μl。

(10) 轻轻混匀，于 94℃ 30秒，50℃ 1 min，72°C 2 min 的条件下扩增 3 个循环。然后再在 50℃ 1 min，72℃ 5 min 的条件下反应 4 个循环。

(11) 用等体积的酚：氯仿（1: 1) 抽提 PCR 产物，用 30 μl 3 mol/L 乙酸钠及 750 μl 乙醇进行沉淀，将沉淀重悬于 20~30 μl DEPC 水中。

(12) 取 1/10 体积的 PCR 产物进行 1% 非变性琼脂糖凝胶电泳分析。

4. 构建 cDNA 质粒文库及转化

(1) 用 PCR 产物回收试剂盒回收 cDNA，去除剩余的引物。

(2) 用 100 U 的 EcoR Ⅰ消化纯化的扩增 cDNA 产物，终体积为 150 μl，于 37℃ 反应 2 h。

(3) 同时用 10 U 的 EcoR Ⅰ消化 500 ng 质粒 pGEM-7Z，终体积为 10 μl，于 37°C 反应 2 h。然后加入 2 μl 小牛肠碱性磷酸酶（CIAP）、10 μl 10X CIAP 反应缓冲液，补加 DEPC 处理水至终体积为 100 μl，于 37℃ 温育 30 min。加入 2 μl 0.5 mol/L EDTA，于 65℃ 保温 20 min 终止反应。

(4) 分别用等体积酚：氯仿（1 : 1) 抽提两种 EcoR Ⅰ消化产物。

(5) 于 4℃ 10000 g 离心 5 min。

(6) 用等体积氯仿：异戊醇（24 : 1 ) 抽提水相。

(7) 于 4℃ 10000 g 离心 5 min。

(8) 于上清中加入 0.1 体积乙酸钠及 2.5 体积乙醇，干冰/乙醇浴中放置 30 min 沉淀 DNA。

(9) 于 4℃ 10000 g 离心 30 min。

(10) 用 1 ml 80% 乙醇洗涤沉淀。

(11) 于 4℃ 10000 g 离心 5 min。

(12) 用旋转真空浓缩仪干燥样品，加 10~12 μl DEPC 处理水溶解沉淀。

(13) 把 1~5 ng EcoR Ⅰ处理的扩增 cDNA 与 100 ng EcoR Ⅰ处理并去磷酸化的 pGEM-7Z 载体用 T4 DNA 连接酶连接，加入 1.5 μl T4 DNA 连接酶及 1.5 μl 10X缓冲液，终体积为 15 μl。

(14) 室温连接 3~3.5 h，样品转化前可保存于 4℃。

(15) 取 5 μl 连接产物加入到 100 μl JM109 感受态细菌中，轻轻混合，冰浴 30 min。

(16) 于 42℃ 热休克 2 min。

(17) 迅速置于冰上 2 min。

(18) 加入 1 ml 预热至 37 ℃ 的 SOC 液体培养基。

(19) 于 37°C，150~200 r/min，振荡培养 1 h。

(20) 取 100 μl 均匀涂于 LB/氨苄平板培养基上。

(21) 37℃ 培养过夜。

5. 克隆筛选

(1) 用 PCR 方法鉴定插入片段的克降。用牙签蘸取每个克隆加入 100 μl TE 中。

(2) 100℃ 加热 10 min。-20℃ 保存模板待用。

(3) 混合 10 μl 模板、10 μl 10X PCR 缓冲液、8 μl dNTP( 每种 10 mmol/L）、100 ng SP6 启动子引物、100 ng T7 启动子引物、1 μl Taq 酶，补充无菌水至终体积为 100 μl。

(4) PCR 扩增，94℃ 40 s，50°C 1 min，72℃ 2 min，共 35 个循环。

(5) 用 1% 非变性琼脂糖凝胶分析 PCR 产物。

(6) 取阳性克隆进行序列分析。