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        用 dUTP 净化 PCR 产物的实验

        相关实验:用 dUTP 净化 PCR 产物的实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 试剂

        (1)dNTP溶液(含有dATP、dCTP、dGTP和dUTP,每种浓度10 mmol/L)多数情况下,直接替换dUTP就可以了(RySandPersingl993;Koxetal.1994)。如果必要的话,为了补偿对聚合酶的抑制作用,dUTP终浓度可提高到 0.6~1 mmol/L(Wangetal.1992;Hohlfeldetal.1994)。

        (2)MgCl2溶液,50 mmol/L

        多数情况下Mg2+终浓度达到1.5 mmol/L就足够了,然而应根据核苷酸(如dUTP)浓度和引物特异性适当优化。提高核苷酸浓度同时应提高Mg2+浓度。

        (3)PCR缓冲液,10X(100 mmol/LTris-HCl , pH8.4,500 mmol/L KCl )

        2. 引物

        正向引物(l0umol/L)

        反向引物(l0umol/L)

        3. 酶

        (1)尿嘧啶-DNA-糖基酶,1U/ul(Invitrogen)

        1UUDG 可以去除 5ng 污染物,根据要求的净化程度可以减少到0.01 活性 U(KoxetaL1994)B(2)Taq DNA 聚合酶 5U/ul

        热启动 Platinum7'叫 DNA 聚合酶 Invitrogen10966-018) 允许在室溫条件下准备 PCR 反应液。

        4. 设备

        可以设定程序(注意在「二、方法」中的(3)和(4)有修改)的 PCR 仪、PCR 扩增用薄壁离心管。

        二、方法

        (1)在灭菌的离心管中于冰上加入下列试剂。

        10 x PCR 缓冲液                  5ul

        dNTP 溶液                            1 ul
        注:dNTP 溶液,含有 dATP、dCTP、dGTP 和 dUTP, 每种浓度 10 mmol/L

        正向引物、反向引物             1 ul(每种 l0umol/L)尿嘧啶-DNA-糖苷酶 1U/ul       1U

        TagDNA 聚合酶(5U/ul)      0.5ul

        MgCl2(50 mmol/L)                 1.5ul

        H20                                         40ul

        (2)37°C 温育 l0min。

        这一步 UDG 可以从污染物中去除屎嘧啶残基。据报道这一净化过程也可以在室溫条件下完成(dcWitetal.1993;Wangetal.1992).

        (3)94°C 加热 l0min, 失活 UDG 并水解污染的 DNA(Hohlfeldetal.1994;Koxetal.1994)。

        (4)在标准 PCR 基础上增加 2 个循环。

        增加 2 个循环可以补偿 dUTP 对扩增效率的影响(Longoetal.1990)。

        (5)在 PCR 结束之前,将温度保持在 72°C, 直至储存。

        据报道,PCR 结束后如果降低温度,大肠埃希菌 UDG 会恢复一小部分催化活性。

        (6)把含尿嘧啶 DNA 以及含有 UDG 活性的反应混合物 -20°C保存。

        来源:丁香实验

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