斑点和狭缝杂交

一、材料与设备

1) 狭槽

2) 点样器

3) 真空泵

4) 可烫封塑料袋或杂交管

5) 硝酸纤维 K 膜或尼龙膜

6)Whatman3MJV1 滤纸

7) 去离子甲酰胺

8) 甲醛（37%)

9)20XSSC

10)0.1mol/LNaOH

11) 预杂交液：50% 甲酰胺，5XSSC，2XDenhardt, 0.1%SDS，100ug/ml 鲑精 DNA。

二、操作方法

(-）样品处理

将 l0ulRNA10ug，（RNA 可多至 50ug) 水溶液与下述溶液混合：

100% 甲酰胺                                                  20ul

甲醛（37%)                                                     7ul

20XSSC                                                          2ul

于 60℃ 温育 15 min 使其变性，冰浴冷却样品。

(二）点样

用 0.lmol/LNaOH 清洗点样器，再用 DEPC 水充分冲洗。将一张经 20XSSC 浸润的 Whatman3 MM 滤纸铺在点样器上，上面铺张经 20XSSC 浸润 30 min 的硝酸纤维素膜，加盖并夹紧，接通真空泵。用 10XSSC 清洗各样孔。在每一 RNA 样品中加 2 倍体积的 20XSSC，混合后加样。于外围几个孔中加染料定位，缓慢抽吸，毎孔用 lml10XSSC 淸洗 2 次。继续抽吸 5 min，吸干滤膜。

(三) 固定

取出滤膜，室温晾干后，夹在 2 张 Whatman3 MM 滤纸中间，80℃ 干烤 2 h 以固定RNA

(四）预杂交

滤膜烘干后放入可烫封塑料袋 (或杂交管）中，加入 20〜30 ml 预杂交液，密封塑料袋后在 42°C 预杂交 3 h

(五）探针制备及标记

参见前面相关章节。

(六）杂交

将已标记的探针煮沸变性 l0 min，取出后立即置冰浴 10 min(单链探针不需要变性），将变性探针加入预杂交液中，密封杂交塑料袋后在 42℃ 杂交过夜。

(七）洗膜

杂交结束后，分別用下列洗液洗膜：

1)2XSSC，0.5%SDS，室温洗膜 5 min。

2)1XSSC,0.1%SDS，42°C 洗膜 30rnin。

0.1XSSC，0.5%SDS，56℃ 洗膜 30 min。

(八）检测

用 X 射线片进行放射性自显影，附加增感屏，一 70°C 曝光 7〜10 天。

1) 使用快速制备法获得的细胞总 RNA 有可能污染基因组 DNA, 因此难以用分光光度计来精确测定 RNA 含量。此外还必须防止上样矫作物的出现。对半定最分析来说，每一样品须做两次狭缝印迹，一张膜与所要检测的 RNA 探针杂交，另一张则与另-种RNA 探针杂交，这种在各个样品中的表达都应一样，或者也可以对一个样品制作-次印迹，但同一张膜必须进行两次重复杂交。

2)RNA 样品在点样时要稀释 8 倍，因此样品的浓度至少为 10mg/mL

3) 狭缝杂交很容易出现假阳性性信号。这可通过以下手段尽可能的避免：①用 Northern 印迹方法严格鉴定探针的特异性；②在所用测试中均需要有适当的阴性对照；③须非常细心地制备所用探针、溶液、RNA 等以避免污染。