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        RNA 光谱分析与定量

        相关实验:RNA 光谱分析与定量

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料与设备

        1)紫外分光光度计。

        2) 石英比色杯。

        3)DEPC

        4) 无核酸酶的水。

        二、操作方法

        (一)准备分光光度计

        用 0.1%DEPC 水浸泡比色皿至少 15 min。

        2) 用水或无 UV 吸收的缓冲掖设置基线。

        3) 用水或无 UV 吸收的缓冲液稀释 RNA 样品,并进行检测

        4) 记录样品在波长为 230nm、260nm 和 280nm 处的吸收值,并打印 200〜300nm 的扫描曲线。

        (二)分光光度扫描曲线的分析

        在-些情况 1F 有必要通过扫描分析而了解污染程度,而不是仅仅测定 260nm 和 280mn 的吸收值。抽提后残留的微量酚、硫氰酸胍的扫描图有明显的差别,A260:A280 的值会有细微差别,m 仍属于可接受的范围,而 RNA 浓度会苻显著的改变。

        由此,当用分光光度法分析 RNA 比值和浓度时,不仅要考虑 280nm,260nm,230nm 的吸收值,而更要在 200〜300nm 范围内进行扫描,在抽提 RNA 过程中所用试剂的微量残留物能够影响并误导测定结果, 继而影响后续试验

        (三)RNA 定量

        根裾 RNA 样品在 260mn 处的光吸收值和样品的稀释倍数,紫外分光光度计可以直接测出样品的浓度,也可以按下式汁算:RNA 浓度 (ug/ml)=(A260X 稀释倍数)/(0.024XL) 式中:A260 为 260mn 波长处光吸收值;L 为比色池厚度,一般为 1 cm 或 0.5 cm;0.024 为每毫升溶液内含 1ugRNA 的光吸收值。当比色池厚度为 lcm,样品 A260 为 1 时,RNA 的浓度约为稀释倍数 X40ug/ml。

        注意事项

        1) 整个操作过裎中应戴手套,尽量减少外源性 RNase 活性的影响。

        2) 通常建议用凝胶电泳而不用分光光度法分析 RNA。因为电泳不仅能显示 RNA 的完整性,而且在多数情况下,能显示 RNA 的种类,如原核细胞的 18S/23SrRNA 和真核细胞的 18S/28SRNA

        3) 根据用 EB 对条带的分析可以大致确定 RNA 的浓度。

        4) 除此之外,还可以通过荧光染色和 Agilent2100 生物分析仪对 RNA 样品进行定量和完整性的分析。一些荧光染料,如RiboGreen,与核酸结合后其荧光强度显著增强, 浓度为 lng/ml 的 RNA 经 RiboGreen 染色后可用荧光分析仪检测和定量。对 RNA 进行精确定量时,可先用已知浓度的样品设置标准曲线,当使用两种不同染料浓度时,用 RiboGreen 定最的线性范围包括三个数量级 lng/ml〜lug/ml)。并且,RiboGreen 分析方法对样品中的非核酸物质相对不敏感,因此_浓度与吸光值具有线性关系。使用该方法时应注意以下几点:首先,RiboGreen 不能区分 DNA 和 RNA,因此要用无 RNase 的 DNase 去除 DNA; 其次,RiboGreeii 能够吸附在试管壁上, 要用非吸附的、无核酶的聚丙烯塑料管; 再次,为了避免 RiboGreeii 试剂被光降解,应避光保存试剂,并在制备后的几小时内使用;最后,应避免反复冻融 RNA 标准品,以免引起 RNA 链的剪切从而降低与染料的结合能力。另外,在核酸浓度低时,反复冻融会使其吸附在管壁上

        5)Agilent2100 生物分析仪结合毛细管电泳、荧光染色等技术,能够对 RNA 进行定量和完整件分析□其最大的优势在于对 RNA 完整性的分析,它能显示 18S 和 2SS 核糖体 RNA 的峰值和比例;另外,它对 mRNA 和 aRNA (tantisenseRNA) 的完整性分析也很有特点,完整的 mRNA 和 aRNA 主要由 lkb〜2kb 之间的条带组成,如果出现较多的低分子质量条带, 则意味 RNA 的完整性较差。

        来源:丁香实验

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