原核细胞体外翻译系统

―、材料与设备

1) 无核酸酶的水。

2)[35S] 标记的甲硫氨酸（1.25×10-5mol/L12000Ci/mmol)

3）1 mmol/L 缺少中硫氨酸的氨基酸混合物

4) 缺少氨基酸的 S30 反应混合液（Promega 公司）

5) 适用于杯状 DNA 的 S30 提取物（Promega 公司）

6) 适用于线状 DNA 的 S30 提取物 (Promega 公司）

7) 适用于环状 DNA 的 T7S30 提取物 (Promega 公司）

8)—70℃ 冰箱

9) 微量移液器

10) 离心机

11) 冰浴

二、操作方法

(一）适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统
           
      
2）轻轻涡旋，然后离心 5s, 以使反应混合物沉入管底。

3)37℃ 孵育 1〜2 h。

4) 将反应管置于冰浴上 5 min, 以终止反应。

5) 分析试验结果。利用三氯乙酸（TCA) 免疫沉淀实验和 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳以分析产物，

(二）适用于对线状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统

具体操作步骤同「(一）适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统」中的 1)〜5)。反应体系如表 4.2 所示



(三) 适用于对环状 DNA 迸行体外翻译的大肠杆菌 T7S30 提取物系统

具体操作步骤同「一）适用于对环状 DNA 进行体外翻译的大肠杆菌 S30 提取物系统」中的 1)〜5)，反应体系如表 4.3 所示；

1)DNA 用量的优化。逋常，一个反应体系屮不应包含超过 4ug 的 DNA。因为随 DNA 的不断增加将会导致较多的未掺入标记氨基酸的目的蛋白的产生、从序列内部起始翻译反应的增加以及过¥结朵翻译的产物的不断增加。

2) 因为 S 标记的氨基酸极易被鉍化成亚砜类而失去活性，故应将 [35S] 标记的甲硫氨酸分装后保存于一 70℃, 每次融化后使用，以取得最好的反应结果。

3) 模板 DNA 和水的纯度是非常重要的。如果翻译效率低下，则应检查水与模板的纯度。

4) 反应可在 24〜37℃ 的温度范闱内进行，37°C 时反应速度最快，需时约 2 h。较低的温度会导致较低的催化速率，且反应时间会相应延长数小时。假如在 37°C 反应 lh 没冇产牛预期的结果，则应尝试在低温反应较长的时间，这样有利于增加蛋白的表达量和蛋白表达的特异性。