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        核转录分析

        相关实验:核转录分析

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一材料与设备

        1)cDNA

        2)PBS

        3)NP-40 裂解缓:0.5%NP-40,10mmol/LTris-HCl(pH7.4),3 mmol/LMgCl2,10 mmol/LNaCl

        4)20XSSC:3mol/LNaCl,0.3mol/L 柠檬酸钠 (pH7)。

        5)1mol/LNaOH

        6) 甘油储存缓冲液:40% 甘油,50 mmol/L Tris-HCl (pH8.3) 0.5 mmol/L MgCl2, 0.lmmol/L EDTA

        7)10X 转录缓冲液:l00 mmol/LTris-HCl(pH7.5),50 mmoI/LMgCl2,800 mmol/LKCllmmol/LEDTA,5 mmol/LDTT

        8) 核苷酸:ATP,GTP,CTP

        9)200uCi「α32P]-UTP:3000Ci/nmol。

        10)10XSET;5%SDS,50 mmol/LEDTA,50 mmol/LTris-HCl(pH7,4)

        11) 蛋占酶 K

        12) 无 RNase 的 DNase:1Omg/mL

        13)CaCI2:20 mmol/L

        14) 硫氰酸胍溶液:4mol/L 硫氰酸胍,25 mmol/h 柠檬酸钠 (PH7.0),0.5%Sa    rcosyl0.lmol/L2-疏基乙醇

        15)Tris-SDS 缓冲液:Tris-HCl(PH7.2),1 mmol/LEDTA,0.1%SDS

        16) 水饱和酚

        17) 氯仿:异戊醇 (49:1)

        18)0.45um 硝酸纤维素/尼龙膜,

        19) 无水乙醇。

        20) 异丙醇。

        21) 酵母 tRNA:10 mg/ml。

        22) 乙酸钠:2mol/L

        23) 紫外交联仪 D

        24) 狭缝印迹装

        25) 杂交箱。


        二、操作方法


        下面每一步均在 0-4°C 进行

        1)用冷的 PBS 洗 1X107-5X107 个细胞,1500 g 离心 5 min 收集细胞。

        2) 去除上清,重悬细胞于 PBS 中,1500 g 离心 5 min 收集细胞。

        3) 去除上清,加入 4 mlNP-40 裂解液,温和涡漩振荡, 冰上放置 10 min

        4) 于 4℃,400 g 离心 10 min 沉淀细胞核。用 NP-40 裂解液洗涤一次.

        5) 用 200ul 甘油缓冲液重悬沉淀,在显微镜下观察细胞裂解情况。

        6) 分装,冻存于液氮中。

        (二)核转录

        1) 在无菌离心管中加入:3X107 个细胞核,35% 甘油,20ul1OX 转录缓冲液,4 mmol/LATP,GTP,CTP,200uCi(α32P]-UTP, 加蒸馏水至 200ul 于 26°C 温育 10 min

        2) 加入 10ul_DNase1,10ul20 mmol/LCaCl2,于 26℃ 温育 lOmin,酶切核 DNA。

        3) 加入 2ul 蛋白酶 K,25ul10×SET,5ul 酵母 tRNA,于 37℃ 温育 30 min。

        4) 加入 550ul 硫氰酸胍溶液,90ul2mol/LNaAc,900ull 水饱和酚,180ul 氯仿/异戊醇,置于冰上 15 min。

        5) 于 4℃,12000 g 离心 15 mm, 吸出水相。

        6) 加入等体积异丙醇,一 20℃ 沉淀 1-2 h。

        7) 于 4℃12000 g 离心 15mim 用 300ul  硫氰酸胍溶液溶解沉淀,

        8) 加入等体积异丙醇,一 20℃ 沉淀 1-2 h,

        9) 与 4℃12OOOg 离心 15mim, 用 70% 乙醇洗涤沉淀,用 1 mlTris-SDS 缓冲液溶解沉淀。总活性为 1X107-2X107cpm。

        (三) 杂交分析

        1) 在 100ul 的 25ug cDNA 探针或 50ug 线性质粒中加入 10% 体积的 lmol/LNaOH,使之变性。

        2) 温育 15 min, 用 10 倍体积 6XSSC 中和。

        3) 剪裁大小合适的硝酸纤维素/尼龙膜。用 0.4mol/LTris(PH7.0) 溶液将膜浸泡30 min, 而后将膜置于狭缝印迹装置上。

        4) 将 1-5ug DNA 加至膜上,真空状态下于 80℃ 烘烤 2 h 或紫外交联 2 min。

        5) 按常规方法进行预杂交,杂交。

        6)X 射线片,显影分析。

        注意事项

        1) 洗膜的时间可根据实验确定. 上要考虑使用的探针的性质和力求莸得最小背景。

        2) 细胞核的质量是核失控转录测定的关键。Dounce 匀浆器有助于制备不易被 NP40 裂解的细胞的核。

        来源:丁香实验

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