从聚丙烯酰胺凝胶中回收 RNA 片段

一材料与设备

1) 溴化乙锭：10 mg/ml 的水溶液

2) 洗脱缓冲液：80% 的甲酰胺溶于 40 mmol/LPIPES，lmmol/LEDTA 和 400 mmol/LNaCl(如要回收 35S-标记的 RNA，需含 l0 mmol/LDTT)

3) 储存液：1Ommol/LDTT 的无菌水溶液

4)8mol/LLiCl 溶液

5) 异丙醇

6)70% 乙醇

7)1XTBE 缓冲液

8) 聚丙烯酰胺凝胶电泳槽

9) 金属小铲

10)Whatman3 MM 滤纸

11) 玻璃棒

12) 表面皿

13) 保鲜膜

14) 透射紫外灯

15) 刀片

16)Texta 笔

17）射线胶片。


二操作方法

(一）准备工作

对 RNA 样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。

(二）回收目的 RNA 片段

1. 非放射性标记 RNA 片段回收

1) 将凝胶板从电泳槽中取出，并将之平放桌上。假如只有前板被硅化了，那么在分离两板前将凹面的后板面朝上放置。分离两板后，凝胶应仍粘在前板上，在两板间插入一金属小铲，小心撬开两板。若凝胶粘在 G 板上，则将平板翻转过来，再试一次。总之，凝胶最终应仍粘在其中的一块玻璃板上，作为支持。

2) 两块玻璃板被分开后，将凝胶置于一块 Whatman3 MM 滤纸上。将玻璃板水平放置，凝胶朝上，然后将一张事先湿润的比凝胶大 2〜3 cm 的 Whatman 滤纸放在凝胶表面, 用玻璃棒在滤纸的表面轻轻滚动，以除去气泡和皱褶并使滤纸平整的粘在凝胶去除滤纸的一角. 然后将两者从玻璃板上取下来。应一次取出纸和凝胶，操作时应注意动作要轻。然耵将两者浸入一较浅的表面皿中，皿中盛有溶于 1XTBE 的 0.5 mg/ml 溴化乙锭，染色 15〜45 min 后，取出凝胶和滤纸

3) 放置一片质量较好的保鲜膜于透射紫外灯的表面，将有凝胶的一面置于其表面，轻轻剥去 Whatman 滤纸后. 可用透射紫外光观察凝胶。

4) 确定目的 RNA 条带，然后从保鲜膜上切下目的带，置于离心管中。

5）用吸头挤压凝胶块，压碎凝胶。在其上覆盖 1〜2 倍体积的洗脱缓冲液，可加至 0.5 ml,37℃ 孵育，同时不断轻轻振荡，以有利于 RNA 的洗脱。3〜4 h 之内小于 500bp 的片段将被洗脱下来. 更大的片段可能需要大约一天的时间才能被洗脱下来。

6) 离心，回收上清液，再用 0.5 体积的洗脱缓冲液漂洗凝胶，离心，回收上清液 „合并上清液。

7) 用一倍体积的异内醇沉淀 RNA，离心回收由于小片段的 RNA 回收是十分完全的，故此处无需添加 RNA 载体

8) 用 70% 的乙醇洗 RNA 沉淀，然后用 10 mmol/L 的 DTT(如有可能最好加入 RNA 酶抑制剂）重悬 RNA。加入 0.1 体积8mol/LLiCl 和等体积的异丙醇重新沉淀 RNA

9) 离心冋收 RNA,70% 的乙醇洗涤 RNA 沉淀。

10) 将 RNA 样品溶于 10 mmol/LDTT 中，一 70℃ 保存。

1 放射性标记 RNA 片段回收

1) 同前述的方法撬开两板，然后在凝胶表面覆盖一层保鲜膜。

2）用 Texta 笔在保鲜膜上标记好凝胶的左右两边界。在暗室中将 X 射线胶片进行曝光，凝晈要恰好放置于 X 射线胶片的上层。在黑暗中曝光 1〜2 min 后，显影。此时，相比于胶片上的凝胶背景，保鲜膜上所作的标记将呈现半透明的状态，面成功标记的 RNA 将呈现较浓的黑色的条带。

3) 通过保鲜膜上的标记以及胶片上的标记可勾勒出凝胶的轮廓并确定 RNA 条带的位置。透过保鲜膜切下相成的凝胶条带，然后同前述的方法回收 RNA 片段。

1)Whatman 3MM 滤纸贴放到凝胶表面时，注意防止气泡和皱褶的产生。

2)在橾作放射性标记的片段时.应注意防护，以防止放射性损伤