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        甲型肝炎病毒 RNA 提取

        相关实验:甲型肝炎病毒 RNA 提取

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一材料与设备

        1)TSES 缓冲液:0.2mol/LTris-HCl,0.05mol/LNaCl0.011mol/LEDTA,0.5%SDS

        2)TSES 缓冲液饱和酚

        3) 氯仿:辛醇 (24:1)

        4) 乙酸钾

        5) 乙醇

        6) 缓冲液 A:0.lmol/LTris-HCl(pH7.4),50 mmol/LNaCl10 mmol/LEDTA,0.2%SDS

        7)lmol/LNaH2P04 缓冲液,pH7.4

        8) 氯胺 T 溶液:100ug 氯胺 T 溶于 25ul50 mmol/LNaH2P04

        9)Na125I

        10)5 mmol/LNa2S2O5

        11)l00 mmol/LKI

        12)SephadexG-25 柱

        13)NET 缓冲液:10 mmol/LTris-HCl(pH7.4),100 mmol/LNaCllOmmol/LEDTA

        14) 酵母 tRNA

        15) 蔗糖

        16) 寡聚脱氧胸苷 (digo-dT) 纤维素柱

        17) 纤维素柱平衡液:0.5mol/LNaCl,1 mmol/LEDTA,20 mmol/LTris-HCl(pH7.6),0.1%SDS

        18) 三重蒸馏水

        19)0.1mol/LNaOH

        20)5 mmol/LEDTA

        21)0.1mol/LNaCL

        22)TES 缓冲液:10 mmol/LTris-HCl(pH7.5),lmmol/LEDTA,0.05%SDS

        23)3mol/LNaAc

        24) 多聚尿瞭陡核甘酸柱 (polyuridylic-acid-Sepharose4B)

        25) 甲酰胺


        二操作方法

        1. 酚:氯仿:辛醇法全 RNA 提取与纯化

        1) 向纯化的甲型肝炎病毒 (HAV) 内加入一定体积的 TSES 缓冲液。

        2) 振荡 30s 至 1 min,置冰浴中 15 min。

        3) 加入 1/2 体积的 TSES 缓冲液饱和酚,再加 1/2 体积的氯仿:辛醇, 将混合液振摇 5〜lOmin

        4) 在 4°C 下,2500r/min 离心 20 min。

        5) 吸出水相,再加入 1/2 体积的 TSHS 缓冲液饱和酚及 1/2 体积氯仿:辛醇,按上述步骤反复抽提 4 次。其水相为全核酸。

        6) 全核酸内加入 2% 乙酸钾及 2 倍体积的冷乙醇,-20℃ 放置 2 h 后,用细玻璃棒或长注射针头轻轻搅动,去除絮状物 (DNA)

        7) 在 4°C 下,4000r/min 商心 20 min。

        8) 弃去上清液,将沉淀再次溶于原体积的缓冲液 A

        9) 加蛋白酶 K 至终浓度为 200ug/ml,37℃ 孵育 1〜2 h

        10) 再 TSES 饱和酚:氯仿:辛醇抽提一次。在 4℃ 下 4000r/mim 离心 20 min

        11) 沉淀复溶于原体积缓冲液 A, 再加入 2.5 倍体积的冷乙醇,一 20℃ 放置 2 h

        12)10000r/min 离心 30 min,沉淀为全 RNA。


        2. 氯胺 T-蔗糖密度梯度起离心法纯化全 RNA

        1)TSES 饱和酚:氯仿:辛醇抽提 4 次可获得 HAV 的全 RNA

        2) 向全 RNA 提取物中加入 10ul1mol/LNaH2PO4 缓冲液,10ul 氯胺 T 溶液,如需碘化标记时再加 15ulNa125I

        3) 混合物于 25℃ 振摇 25 min

        4) 加入 l00ul5 mmol/LNa2S2O5 及 200ul100 mmol/LKI,以终止反应

        5) 将反应产物中的碘化物去除. 经 SephadexG-25 柱层析, 洗脱缓冲液为 NET

        6) 洗脱收集液用无水乙醇沉淀,沉淀时加入 100ul 酵母 tRNA 为载体。

        7) 在 4℃ 下,10000r/min 离心 30 min

        8) 再在沉淀屮加入乙醇洗两次,离心同 7)。

        9) 沉淀复溶于 NET 缓冲液。

        10) 蔗糖密度梯度超离心,取 500ul RNA 样品加入 4 ml15% 至 30% 用 NET 缓冲液制备的蔗糖禅度溶液。在 7℃下,310000r/min 比离心 2.33 h。离心后可见 4 个峰,即 4S、18S、28S 及 35S. 酶特异性实验证明,35S 部分对 DNA 酶不敏感,而对 RNA 酶敏感,因此,这一部分被证明是 HAVRNA。

        3)Poly(A)+RNA 的提取

        经上述酚:氯仿:辛醇及密度梯度超离心后,对于所收集的 35SRNA 部分可釆用下列方法分离含多聚 (A) 的 HAVRNA。

        1) 寡聚脱氧胸苷 (oligo-dT) 纤维素柱层析分离法。①柱床根据分离暈而定,如 0.5 cmX2 cm 或 lcmX4.5 cm 等。②用纤维素柱平衡液平衡纤维素。③装柱,以无菌的三蒸水和 0.lmol/L NaOH 及 5 mmol/L EDTA 循环洗三次,最后以水洗,再用含 0.lmol/L NaCl 的平衡液洗一次。④加样,样品用无菌的三蒸水稀释,水浴处理 5mim, 冷却, 加入柱内⑤用 2〜3 倍柱体积的 TES 缓冲液洗脱,收集洗脱液,洗脱至 A260<0.03。⑥收集 A260 峰值部分,加 3moL/LNaAc 及 2.5 倍体积的乙醇,一 20℃ 放置⑦在4℃,10000r/min 离心 30 min.⑧沉淀复溶于水,测 OD 值,计算 RNA 含暈,即得含多聚(A) 的 HAVRNA

        2) 多聚尿嘧啶核苷柱(polyuridyncaad-Sepharcst-4B) 层析法。实验操作方法及步骤与 1) 法基本相同。柱床为 lcmX2 cm, 柱层平衡液为 1 份甲酰胺及 3 份 NET 缓冲液,平衡和洗层析柱 5 次. 含多聚(A)RNA 洗脱收集液为 9 份甲酰胺及 1 份的 NET 缓冲液,RNA 洗脱收集后,沉淀、浓缩及干燥。RNA 样品应储存于-70℃ 备用.

        来源:丁香实验

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