苯酚法制备酵母tRNA

一 材料与设备

1)DEAE 纤维素：称取 20 g 交换量 l.Ommol/gDEAE 纤维素，先用 300 ml0.5mol/L 氢氧化钠浸泡 1〜2 h 搅拌, 倾去上清液后水洗至中性。

2) 二乙醇胺 (TEA) 溶液：先用浓 HC1 调至 pH7.4, 然后稀释成 lmol/L 作为储液。

3)0.lmol/LTEA 缓冲液 (pH7.4)

4)0.lmol/L 氯化钠含 0.lmoi./LTEA 缓冲液，pH7.4,

5)12mol/L 氯化钠含 0.lmol/LTEA 缓冲液，pH7.4。

6)lmol/L 氯化钠含 0.lmol/LTEA 缓冲液，pH7.4。

7) 乙醚。

8) 水饱和酚。

9) 乙醇，

10) 皂土

11) 电动搅拌器。

12) 离心机，

13) 部分收集器。

14) 紫外分光光度计。


二 操作方法

1)250 g 新鲜面包酵母，加入 375 ml 蒸馏水，搅匀成糊状。

2) 再加入 500 ml90% 苯酚（改变细胞透性，使蛋白变性），电动搅拌 lh 后，放置于冰箱中过夜。

3)4000r/min 离心 15 min, 弃去上清液，下层为酚相，小心吸出后 (避免吸入蛋白质），每升加 20 g 乙酸钾和 2L 乙醇使 tRNA 沉淀，-20°C 过夜。

4)4000r/nin 离心 15 min。弃去上清液，沉淀用 95% 乙醇洗一次，4000r./min 离心15 min

5) 沉淀再用乙醚洗一次，4000r/min 离心 15 min

6) 沉淀溶于 25 ml0.1mol/LTEA 缓冲液中. 加入 0.025 g 皂土，1.5 g 氯化钠，0°C 静置 lh，4000r/min 离心 15 min。

7) 上清液用 0.1mol/I.TEA 缓冲液稀释 10 倍，上样到已用的含 0.lmol/LNaCl 的0.lmol/LTEA 缓冲液平衡的 DEAE 纤维素柱. 用含 0.2mol/LNaCl 的 TEA 洗涤，至流出液的 OD260<0.05 为止。

8) 用含 1mol/LMaCl 的 TEA 洗脱，分部分收集, 测定其 OD260，取其峰值部分的液体

9) 加 2 倍体积 95% 乙醇，一 20℃ 过夜（或 2 h)

10)4000r/min 离心 15 min。上清液弃去，沉淀以 67% 乙醇，95% 乙醇，无水乙醇及乙醚各洗一次。

11)4000r/mim 离心, 沉淀真空干燥，电泳检测 tRNA,