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        从果蝇胚胎中提取总RNA或 poIy(A)+RNA

        相关实验:从果蝇胚胎中提取总 RNA 或 poIy(A) +RNA

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一 材料与设备

        1)0.lmol/LNaOH

        2)70%(V/V) 乙醇

        3)3mol/L 乙酸钠,PH5.2

        4) 苯酚

        5) 无 SDS 的结合缓冲液:5 mmol/LEDTA,10 mmol/LTris-HCl(PH7.5)0.4mol/LNaCl

        6) 含 SDS 的结合缓冲液:0,5%(m/V)SDS,5 mmol/LEDTA,10 mmol/LTris-HCl(pH7.5),0.4mol/LNaCI。

        7)TE 缓冲液 1Ommol/LTris-HCl(pH8.0),1 mmol/LEDTA.

        8)SEVAG: 氯仿:异戊醇 (24:1)

        9) 漂白剂(Bleach):50%(V/V) 家用漂白剂(HouseholdBleach)

        10) 含 MgCl2 的 PBS(pH7.2):2.7 mmol/LKCl,4.3 mmol/LNa2 HPO4,,1.8 mmol/LKH2PO4,137 mmol/LMaCl 每升溶液加 lgMgCl2

        11) 果蝇勻浆缓冲液:1%(m/L)SDS,0.15mol/L 乙酸钠,高压灭菌并冷却到室温后加入 PH8.0 的 Tris-HCl 和 EDTA 至终浓度分别为 50 mmol/L,和 5 mmol/L


        二 操作方法

        1. 准备果蝇胚胎

        (二)操作方法
        1) 收集胚胎,用双蒸水漂洗。

        2) 在 50% 漂白剂中去膜,然后用双蒸水漂洗。

        3) 把去膜的胚胎放在液氮中速冻。

        4) 样品可用于提取 RNAt&可以冻存于-60℃

        5) 融化前将胚胎转移到 50 ml 的管中.

        2. 总 RNA 的分离

        1) 在 10 ml 酚和 10 ml 果蝇勻浆缓冲液中勻浆 30s, 以平衡 polytron 匀浆器(以第七档)匀浆。

        2) 加入约 3 倍体积的果蝇匀浆缓冲液(如:.5 ml 胚胎加 5 ml 缓冲液)及 3 倍体积的酚至冻存的胚胎中。

        3)用 polytron 匀浆器以 4.5 挡匀浆 3 次,每次 30s. 勻浆液在液氮中速冻几秒至呈半固体。

        4) 用 8OOml 双蒸水洗涤匀浆器 2〜3 次。

        5) 加等体积的 SEVAG 至勻浆混合液中,振摇混合。

        6) 室温以 5000 g 离心 15 min,分层

        7) 观察离心的溶液.①如果水相非常少而中间层起泡沫,则用宽吸口的吸头把中间层转移到 50 ml 的管中,加入 1.5 倍体积的SEVAG,振摇混合后以 12000 g 离心 10 min. 保存水相继续下面的操作。②如果中间层只有很少泡沫或没有泡沫,则把水相转移到 1.5 倍体积的 SEVAG 中,振摇混合,以 5000 g 离心 lOmin。保存水相继续下面的操作。

        8) 继续用 SEVAG 柚提,至中间层没有泡沫。

        9)在水相中,加入等体积的酚/SEVAG(1:1),按第 7) 步的方法抽提

        10) 继续以酚/SEVAG 抽提,直至看不见屮间层。

        11) 用 SEVAG 抽提水相一两次,保存水相。

        12) 水相中加入 0.1 体积的 3mol/L 乙酸钠和 2.5 体积的无水乙醇。

        13) 颠倒混合,-80℃ 沉淀过夜。

        14) 于 4°C,以 14000 g 离心 15 min

        15) 去上清,室温干燥约 2 min

        16) 以适当体积的水溶解 RNA 沉淀 u 如果用下向的方法制 Poly(A)+RNA, 用含 SDS 的结合缓冲液溶解。

        3. 从总 RNA 中分离 poly(A)+RNA

        1) 按产品说明书水合 3 型 oligo(dT) 纤维素。

        2) 用大量含 SDS 的结合缓冲液清冼纤维素。

        3) 按下列顺序漂洗柱子:10 倍体积的 0.lmol/LNa()H,10 倍体积含 SDS 的结合缓冲液 A 倍体积的 TE 缓冲液,10 倍体积含 SDS 的结合拳冲液

        4) 保存 20ul 总 RNA(溶于含 SDS 的结合缓冲液中)于冰上,将剩余的总 RNA 上样到 3 型 digo(dT) 纤维素柱上。

        5) 收集洗脱液并 fl 过柱两次以上。

        6)冼脱液于-80℃ 保存。

        7) 用 10 倍柱体积不含 SDS 的结合缓冲液洗柱

        8) 用 6 倍柱体积 TE 缓冲液洗脱 poly(A)ˉRNA,在冰上收集洗脱液。

        9) 洗脱液中加 0.1 倍体积乙酸钠和 2.5 倍体积无水乙醇。

        10) 样品于 80℃ 过夜。

        11) 于 4℃,以 14000 g 离心 10 min, 去上清。

        12) 加入与上清等体积的 70% 乙醇漂洗沉淀。

        13) 于 4℃. 以 14000 g 离心 10 min,弃上清。

        14) 用重蒸水溶解沉淀. 分装成适当体积于-80℃ 或 20℃ 保存



        注意事项

        1) 纤维索的用量及柱的尺寸是很重要的,每 1 mg 总 RNA 大约需 lml 纤维素树脂。

        2)3 型 oiigo(dT) 纤维素按下面的方法洗后可保存并可重新利用。先用 10 倍柱体积的 0.lmol/LNaOH 洗柱,再用 10 倍柱体积含 SDS 的结合缓冲液洗柱. 装有含 SDS 结合缓冲液的纤维素柱密封后可于室温保存

        来源:丁香实验

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