方案26.3 旋转瓶培养

将细胞悬液加入到圆形培养瓶中，然后将培养瓶放在旋转架上缓慢转动。

1. 用胰蛋白酶消化细胞，以通常密度种植。

旋转瓶中的气相较大， 故用基于 Hanks 盐和空气气相的培养基，可能需要向培养瓶内充入少量 5% CO₂ （如 10 L/min，2 s）。如果培养液是用 CO₂/HCO₃ 缓冲的， 气相应该用 5% CO₂ 调整（20 L/min，30s~1 min，以瓶的大小决定）。

2. 将培养瓶放在旋转架上，以 20 rph 的速度转动，直至细胞贴壁（24~48 h ) 。

3. 细胞密度增大时，加快旋转速度至 60~80 rph。

4. 给细胞加培养液或收集培养液时，可将培养瓶取到无菌工作区，如通常一样排出培养液，然后更换新鲜培养液。假如体积不是关键问题，输血装置或培养液袋对于添加新鲜培养液是有用的。如果培养液容量至关重要，可用吸管滴加或用一个蠕动泵计量。

5. 收获细胞：

(a)弃去培养液，用 50~100 ml D-PBSA 浸洗细胞，然后弃去 D-PBSA。

(b)在 4℃条件下，加入 50~100 ml 胰蛋白酶。用手或放在旋转架上以 20 rpm 将培养瓶转动 15 s。

(c)吸出胰蛋白酶，将培养瓶内的细胞消化 5~15 min，然后加入培养液。

(d)摇晃和转动培养瓶，用滴管将细胞洗出。