从福尔马林固定、石蜡包埋的组织中提取RNA

 一 材料与设备

1）RNA 消化液：每 100ml 包含 40ml 4mol/L 硫氰酸胍，3mllmol/L Tris-HC(PH7.6),2.4ml 30% N-十二烷基肌氨酸钠，DEPC处理水（54.6ml)

2）β-巯基乙醇：用前必须将其加入到消化液中，每 l00ul 溶液加 0.28ul 4℃ 储存

3）蛋白酶 K（20mg/ml):溶于 DEPC 水（50%)和甘油（50%)，储存于 一20℃

4）水平衡苯酚:对光和氧化作用非常敏感，为了减少酚的氧化速率，在储存液中加入8-羟喹啉（0.1%）酚/水使用液可放于深色瓶中 4℃ 保存，储存液必须放于 一20°C保存，有效期 2 年

5）氯仿

6）糖原：1.0 mg/ml 溶于水，分装储存 一20℃

7）TE缓冲液：10 mmol/L Tris-HCl(PH8.0),1 mmol/L EDTA(PH8.0)

8）异丙醇

9）乙醇：无水乙醇，95% 乙醇，75% 乙醇

10）DEPC 水


二 操作方法

1.石蜡切片

用标准切片机切片 6-8um 厚，每个标本无须换刀，因为在每次切片中石蜡本身便可清洁刀刃。在切完每个标本后用二甲苯去除刀刃残佘的石蜡，把切片放在 1.5 ml 管中, 为更便于处理切片，最好使用卷起的切片切片前将石蜡块放人冰箱降低温度，可获得这种切片

2. 脱蜡

从组织中抽提第一步用有机溶剂如二甲苯脱蜡，然后必须用乙醇清洗以完全去除二甲苯，因为二甲苯在后续阶段会干扰蛋白酶。

1) 每个 1.5 mlEppendorf 管屮最多放入 5 张切片，片厚 6〜8um，用 lml 二甲苯室温脱蜡 5 min,2 次。高速离心 lOmin，每次保留沉淀。此时应注意沉淀并未很紧密地黏附于管底，小心移去上清液，勿丢失组织碎片。

2) 用 1 ml 无水乙醇冼涤 10 min, 用 95% 乙醇再洗一次, 离心 lOmin, 保留沉淀。

3) 将离心管敞口于 37℃ 放置 30 min, 以除去乙醇，使组织在空气中干燥。

3. 蛋白消化

为获取纯化的 RNA，必须除左组织蛋白，最佳方法是使用蛋白水解酶消化。

1) 在每个千燥样本中加人 1 倍体积（100〜300ul 依据组织切片的量）含β-巯基乙醇 (0.28ul/100ul 溶液）的消化液。

2) 加蛋白酶 K, 最终浓度为 6 mg/ml

3)45℃ 孵育过夜。

4.RNA 抽提

1) 每管加人 1 倍体积的水饱和苯酚：氯仿，比例 7:3

2) 混合均匀，置于冰上 15 min12000 g 离心 20 min。

3) 保留上层水相，将其移到另一管中。

5.RNA 沉淀

用糖原为载体的异丙醇进行沉淀，从溶液中获得 RNA 沉淀。

1) 水相中加 5ul 糖原 (1 mg/ml) 和 1 倍体枳的异丙醇，置于-20℃，48 h。要获得足量 RNA 的沉淀，必须在 20℃ 放较长时间

2)12000 g,4℃ 离心 20 mm。RNA 沉淀并不像 DNA 沉淀那样可紧紧粘附于微最离心管的底部，因此要轻轻倒出。清液，注意不要丢失 RNA 沉淀

3)100ul75% 乙醇洗涤沉淀, 保存于-20℃

1) 硫氰酸胍冇毒. 应通风橱屮处理，在棕色瓶中保存，室温存放，有效期 2 月。

2) 需要高浓度蛋白酶 K.

3) 必须去除蛋白酶 K 和蛋白水解残基以免干扰后续步骤。用酚：氯仿抽提 RNA 时. 蛋白位于有机物和水层之间的界面中，而 RNA 则位于水相

4）用这种方法抽提的石蜡包坪组织中的 RNA 是高度降解的，碎片长度介于 100〜200 个碱基，因固定和石蜡包埋条件不同，不同标本降解程度也不同。