方案14.1 稀释法克隆培养

低密度接种细胞，培养至集落形成，细胞染色（用于克隆形成率和存活检测 ) 或用于筛选时分离细胞、然后扩增为细胞株。

1. 细胞用胰蛋白酶（胰蛋白酶，0.25 %，1 : 250或相当活性）消化制备单细胞悬液。消化不充分会形成细胞团；过度消化会降低细胞活性。就克隆培养而言细胞呈单个悬浮状态是基础。如果是第一次克隆培养新的细胞系，有必要摸索一下消化时间和浓度，以确保能消化成单个悬浮细胞获得最佳克隆形成率。



2. 在细胞消化期间，给培养皿编号（写在培养皿底上）、分出每步稀释用培养基（培养基：Ham F12， 5 % CO₂ 平衡，10 % FBS），也许有必要经过四次稀释才能将原来单层细胞稀释至适于克隆培养的浓度。



3. 待细胞变圆，开始脱落时，加入含血清或胰蛋白酶抑制剂的培养基终止消化，分散细胞。

4. 细胞计数，将细胞悬液稀释至 1×10⁵ /ml，然后再稀释至每个平皿可产生 50 个集落的浓度。对 CHO 细胞（25cm² CHO 细胞，对数生长晚期）而言，是每 ml 10 个细胞，稀释步骤是：



(a)将消化后细胞稀释至 1×10⁵ /ml （约 1 : 10 或 1：20，视培养瓶中细胞数而定）。

(b)取 1×10⁵ 细胞 /ml 200 μl，加至 20 ml （1:100），成为 1×10³ 细胞/ml。

(c)将 1×10³ 细胞 /ml 200 μl，加至 20 ml （1:100），成为 1×10 细胞/ml 。

如果想变换克隆培养条件，如一系列血清浓度、不同的血清或生长因子，此时准备一系列试管，分别在每管中加入 20 μl 1×10³ 细胞 /ml 。

如果是第一次克隆培养测定克隆形成率，选择试用每毫升中 10、50 、100、200 和 2000 个细胞进行实验。

5. 接种 3 个平皿，每个平皿中 5 ml 培养基含末次稀释浓度的细胞。还建议接种每 ml 2000 个细胞的平皿作对照，确认细胞已加人，以防浓度再低时无法形成克隆。

6. 将培养皿放在透明的塑料盒中。

7. 将塑料盒放置于湿润的 CO₂ 温箱中或通气的密闭容器中（2 % ~10 % CO₂）。

8. 静置培养一周，如果有集落形成，进行以下处理：

(a)克隆形成率分析；进行染色和计数集落。

(b)克隆筛选；单个集落的分离。

如果没有可见集落，更换培养基后再培养一个星期，若仍没有集落形成，还可以换培养基后培养第三个星期，再没有集落出现，则不再有可能出现集落。