方案12.7 鸡胚器官原基

切出单一器官或组织，整个置于冷的胰蛋白酶中过夜，去除胰蛋白酶，短暂孵育器官或组织，于培养基中分散细胞，稀释并接种培养物。

1. 如前所述（见方案 12.2 ) 取出胚胎（孵化10~13天的受精卵（>10天在英国需要许可证）），放入无菌的 BSS 中。

2. 除去头部。





3. 切除眼球，小心剖开后清除晶状体、房水、玻璃体。





4. 用两把尖镊子夹住视网膜，轻轻将色素层与神经层及结缔组织分开 （10 天的胚胎需要用解剖镜。用 0.25% 胰蛋白酶（0.25 粗制胰蛋白酶（Difco 1 : 250 或同等级别的产品），以 RPMI1640 或 S-MEM 配制，置于冰上。如果用纯的胰蛋白酶，浓度可降低，如 Sigma 的“结晶级”或 Worthington 的“IV级”可配成 0.05%~0.1% 的浓度）及 1 mmol/L 的 EDTA 溶液短暂浸泡可促使两组织易于分离）。将分离的组织放于一侧。



5. 用弯镊子刺破颅顶，用勺取出脑，将脑、视网膜一起放于皿的一侧。



6. 从躯干的中间断开（此处肝透过腹壁显出粉红色），若切在膈的位置则将从心脏和肝脏之间通过，但有时肝脏会出现在前半部而不是后半部。



7. 轻轻探入切面的前半部，取出心脏和肺（挑出器官，确认后再切），把分离后的心脏和肺放于皿中的一侧。



8. 探入后半部，取出肝脏，由于肠夹于肝脏的两叶之间可一并取出，分离肝和肠放于皿的一侧。



9. 折回体壁后半体腔背侧面的内壁，可见长的分叶状的肾并行排列于中线两侧。

10. 用刀尖轻轻地滑至肾的背面，使肾自躯体背面内侧壁剥离（10 天的胚胎需要用解剖镜），将肾分离下来后放于一侧。



11. 将两把手术刀置于后部未端的中线上，尖端向前，交替前进像挤牙膏一样将脊髄挤出。



12. 将胚胎后部躯干翻转，将皮肤自背部和腿上部撕脱，收集皮肤放于一侧。



13. 自每条腿的股部切下肌肉，收集到一起。



14. 将所有这些收集的组织以及其他所盖要的任何组织分別转入含 1 ml 0.25% 胰蛋白酶的试管中，放于冰上，确认组织块已沉入胰蛋白酶溶液中。

15. 于 4°C 放置 6~18 h 。

16. 小心吸去胰蛋白酶，不要搅动组织块；振动或慢慢旋转试管将有助于消化。

17. 组织块在剩余的胰蛋白酶中 37°C 孵育 15~20 min。

18. 每种组织接种两个 25 cm² 培养瓶，每个培养瓶加 4 ml 的培养基。

19. 向含组织和剩余胰蛋白酶的试管中加入 2 ml 培养基，轻轻上下吸打分散组织。

20. 让大块组织沉淀。

21. 将上清吸入第一个培养瓶中，混匀，将 1 ml 稀释的悬液移入第 2 个培养瓶。这样做使得两瓶的细胞密度不同，可免去细胞计数，而试验可确定细胞的适宜浓度，用于以后的实验。

22. 按需要更换培养基（如脑于 24 h 后更换；视网膜色素层则大约保持 5~7 天），并检测形态学特点和功能。