• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        方案21.11 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数实验

        相关实验:3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数实验

        最新修订时间:

        原理

        细胞培养至适当密度,用1H -胸腺嘧啶脱氧核苷标记 30min,清洗后固定细胞,除去未掺入的前体物,准备同位素放射自显术。

        材料与仪器

        步骤

        材料

        无菌


        培养细胞
        生长液
        0.25% 粗制胰蛋白酶
        D-PBSA
        3H-胸腺嘧啶脱氧核苷,2.0MBq/ml (约 50uCi/ml),75 GBq/mmol (约 2Ci/mmol)
        安全提示 处理 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷时要谨慎, 因为它是放射活性物质和基因产物!要遵照当地指南操作(见 7.7 节)。
        多孔培养板,内含 13 mmThermanox 盖片(Nalge Nunc)

        非无菌

        血球计数板或电子计数器
        D-PBSA
        醋酸甲醇(1 份冰醋酸加入 3 份甲醇),冰冷,新鲜配制
        显微镜载片
        封胶(如 DPX 或 Permount)
        三氯乙酸(TCA ),0.6mol/L ,冰冷
        去离子水
        甲醇

        操作步骤

        1. 在装有盖片的 24 孔培养板中,以 2X104~5X104 个/ml 培养细胞。

        2. 待细胞贴壁,开始增殖(48~72 h) , 让其达到所需要的细胞密度。

        3. 在培养液中加入 3H -胸腺嘧啶脱氧核苷,100KBq/ml(约 5uCi/ml),将细胞继续培养 30 min 。

        提示 某些培养基,例如 Ham’s F10 和 F12,它们含有胸腺嘧啶脱氧核苷 (表 9.3,10.1 和 10.2),那么放射活性的胸腺嘧啶脱氧核苷的浓度要增加,这样方能在培养液内达到相同的特异活性。

        4. 除去标记液体,将它弃于专用的放射废物容器中。

        5. 用 D-PBSA 清洗盖片 3 次。每冲洗一次,要从孔底部揭起盖片(但不要超出该孔),以便使盖片底部的同位素能冲掉。

        6. 加人 1:1 的 D-PBSA : 醋酸甲醇,每孔 lml,然后立即吸去。

        7. 每孔加人 lml 冰醋酸(4℃ ),静止 l0 min。

        8. 取出盖片,用风扇吹干。

        9. 将盖片封固于显微镜载片上,细胞面朝上。

        10. 让封固胶过夜干燥。

        11. 将载片放在含 0.6mol/L TCA 的染色缸中(4°C),静置 lO min,在此过程中更换 2 次 TCA,借此可除去未掺人的前体物。

        12. 用去离子水淋洗,然后改用甲醇,晾干。

        13. 准备放射自显术(见方案 27.3. )。

        14. 当放射自显影进行一段曝光时间(通常 1~2 个星期),显影,染色(见方案 27.3),40 倍显微镜下观察。

        15. 计数标记细胞的百分比。为了涵盖代表区,按图 21.14 所示进行扫描观察。



        方案21.11 3H-胸腺嘧啶脱氧核苷的标记指数实验

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序