TTC法根系活力的测定实验

氯化三苯基四氮唑（TTC）是标准氧化还原电位为80毫伏的氧化还原物质。溶于水中为无色溶液，但还原后通过下列反应，生成红色而不溶于水的三苯基甲臢。反应式如下：　


生成的甲臜呈稳定的红色，不会被空气中的氧自动氧化。所以TTC被广泛地用作酶试验的受氢体。植物根引起的TTC还原，可因加入琥珀酸、延胡索酸、苹果酸得到加强；而被丙二酸、碘乙酸所严重抑制。所以，它能够测定脱氢酶的活性。由该酶活性表示根系活力。

一、仪器设备：

721型分光光度计；温箱；研钵；漏斗；

移液管：0.5  ml 1支、5  ml 3支、2  ml 1支；容量瓶（10  ml ）8个；

二、试剂：

1．乙酸乙酯（分析纯）；

2．连二亚硫酸钠（Na2S2O4），分析纯，粉末；

3．1%TTC溶液：准确称取TTC1.0000克，溶于少量水中，定容到100  ml 。用时稀释至需要浓度。

4．0.1 M  pH7.5磷酸缓冲液。

5．2N硫酸：用量筒取比重1.84的浓硫酸55  ml ，边搅拌边加入盛有500  ml 蒸馏水的烧杯中，冷却后稀释至1000  ml 。

三、材料：

水培或砂培的玉米或小麦根植物材料（需洗净）。

四、方法步骤：

TTC标准曲线制作：

取0.2  ml  0.5%的TTC溶液加入到10  ml 具塞刻度试管中，再加入少许Na2S2O4粉末，摇匀后即产生红色的甲臜。再用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.25、0.50、1.00、1.50、2.00  ml 至10  ml 具塞刻度试管中，以乙酸乙酯定容至刻度，即得到含甲臜 　0.025、0.05、0.10、0.15、0.20毫克的标准比色系列。以空白作参比，在485n M 波长下测定光密度，绘制标准曲线。

定性测定方法：

取样品0.25g放入三角瓶，加入0.5%TTC溶液和0.1 M 磷酸缓冲液（pH7.5）各5  ml 充分混匀，并将根尖完全浸入在溶液中，至37℃保温箱内1小时，保温时间一到立即加入2N H2SO4溶液2  ml 以终止反应。如根尖显红色表明该处具有活跃的脱氢酶存在。

定量测定方法：

取出定性显色的根段，用滤纸吸干外附水分，至研钵中，加乙酸乙酯3－4  ml 研磨。将提取的红色TTF小心倒入刻度试管中，残渣用乙酸乙酯冲洗2－3次，直至洗液不带红色为止，全部洗液合并于试管中，最后用乙酸乙酯定容至10  ml ；摇匀后，以乙酸乙酯为对照于485n M 下比色，记录光密度值。查标准曲线，即可求出TTC还原量。