• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        流式细胞术间接免疫荧光标记的样品制备实验

        相关实验:流式细胞术间接免疫荧光标记的样品制备实验

        最新修订时间:

        原理

        取一定量的细胞悬液,先加入特异的第一抗体,待反应完全后洗去未结合抗体,在加入荧光标记的第二抗体,生成抗原-抗体复合物,以流式细胞仪检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        一、不同来源样品的处理


        1 . 培养细胞


        (1)培养细胞用0.25%的胰酶消化。


        (2)PBS或生理盐水洗涤细胞2次,再用PBS或生理盐水悬浮细胞,加入预冷的无水乙醇,终浓度为60%——70% ,快速混匀,并用封口膜封口,置4℃下可保存15天左右。


        2. 新鲜标本


        (1)将标本切成1——2mm3的小块。


        (2)PBS或生理盐水清洗后去除上清,加入0.2%胶原酶(或0.15%胰蛋白酶)37℃消化10——30min(根据实验及不同组织确定),并不断振动。


        (3)300目尼龙筛过滤,除去组织团块,PBS洗涤2次,300g离心5min,获得已消化的细胞。


        3. 石蜡包埋标本


        (1)标本在切片机上切取3——5片50μm厚的组织片。


        (2)将切片彻底脱蜡,梯度乙醇(100%、95%、70%)及蒸馏水水化。


        (3)0.5%胃蛋白酶(或胰蛋白酶)37℃消化30min,每隔10min振动1次。


        (4)300目尼龙筛过滤,获得的细胞悬液PBS洗涤2次,300xg离心5min。


        注意:脱蜡一定要完全(若加入100%乙醇无絮状物飘起即可);切片厚薄适宜,太薄碎片多,影响FCM分析结果,太厚易造成脱蜡不净;注意掌握消化时间,避免已释放的细胞被消化。


        二、制备


        1. 取1×106个细胞/100μl,先加入一抗混匀,置室温下避光反应30min。


        2. 用PBS洗涤细胞2次,离心沉淀弃掉上清液(离心转数一般为800——1000rpm,5min)。


        3. 用100μl PBS重悬细胞,再加入FITC或PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀,室温下反应30min。


        4. 用PBS再洗涤细胞2次,加入500μl PBS重悬成单细胞悬液,上机检测。


        注意事项

        1. 以上两种染色方法的抗体加入量和反应时间,一般根据试剂使用说明书的要求进行。若说明书上未说明,应先进行预实验,掌握好剂量与最佳反应时间后,再进行流式样品的制备。


        2. 制备好的样品,若不能及时上机检测,用1%——4%的多聚甲醛固定,4℃下可保存5天。

        常见问题

        此法由于二抗一般为多克隆抗体,特异性较差,非特异性荧光背景较强,易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。此外,由于间标法步骤较多,增加了细胞的丢失,不适用测定细胞数较少的标本。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序