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        高效液相层析(HPLC)法

        相关实验:藻类多糖的结构与生物活性研究实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        (1)多糖的纯化是将离心分离出的1000 ml培养液,用40℃真空浓缩到50 ml,再移入到透析袋内于4 ℃蒸馏水中透析三天。早晚更换一次蒸馏水,将透析袋内液体倒入烧杯,边搅拌边加入4倍体积99%乙醇,4 ℃过夜。11000 r/min离心得到沉淀,冷冻干燥获得粗多糖。经DEAE-sephacel柱层析,0~2 mol/L氯化钠梯度洗脱进一步纯化,纯度以醋酸纤维薄膜电泳法[1]鉴定。
         
        (2)分子量的测定是使用TSK-GEL.G300SWXL(7.8 mm×300 mm柱)GPC的高效液相层析(HPLC)法。移动相为1%三己基胺,检测使用示差屈折计(YRU-880RI-UI检测器),同样条件下以Pulluna-ShodexSTANDARDP-82(分子量分别为5.9,11.8,22.8,47.8,112,212,404,788 kU)为标准。
         
        (3)粘度使用TokimecEMD回转粘度计测定,测定条件为25 ℃,回转锥形种类是1°34′,糖浓度为0.5%。
         
        (4)旋光度使用JASCO.DIP-370偏光光度计测定,测定条件是16.9 ℃,糖浓度是0.24%。
         
        (5)元素分析采用的是原子光谱吸收法。
         
        (6)硫酸基定量采用Rhodizonicacid法[2]
         
        (7)薄层层析是将多糖完全水解后,取0.5 ml过微量树脂Dowex1(乙酸型)柱,先用纯水洗脱,收集中性部分,再用0.2 mol/L乙酸洗脱,收集酸性部分,点样于硅胶板(Kieselgel60,10×10 cm)上,使用展开剂(醋酸乙酯∶醋酸∶水=2∶1∶1)展开,50%硫酸喷雾后,100 ℃使其炭化,根据炭化斑点的 Rf 值鉴定糖类。
         
        (8)气相层析是把多糖1 mg用三氟乙酸完全水解后,制成糖醇-乙酰化诱导体后进行的,实验条件为TC-I柱(0.25 mm×20 mm),气化室温度:230 ℃,柱温:140~210 ℃,以1.3 ℃/min升温,载气为氮气,氢离子炎检测。
         
        (9)糖醛酸的定量采用Sulfatedacid-carbazole反应法[3]测定。
         
        (10)H1-NMR光谱分析是将纯多糖溶解于重水,冷冻干燥,重复两次,以丙酮δ2.23为内部标准。光谱是在用质子照射和费林变换装备完全的INOVA-600光谱仪,600 MHz、20 ℃条件下测定的。
         
        将不同组分的多糖或寡糖进行生物活性分析,有活性的进行结构分析。

        常见问题

        [1] Nihonkagakukai , Saccharo-chemstry (lower) , Tokyoukagakudojin, 148~149 , 1976
        [2 ] Louis J . Silverstri , Analysis of sulfate in complex carbohydrates, Ana . Biochen ., 123 , 303~309 , 1982
        [3 ] Midori K . Physics and Chemistry Dictionary , IwanamiBookshop , 47 , 1981

        来源:丁香实验

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