荧光测定法-1

核黄素能形成一种具有黄绿色荧光的黄色溶液。它在稀溶液中，440～500 nm波长下测定的荧光强度与核黄素的浓度成正比。根据其在还原后的荧光差数，可测定核黄素的含量。

溶液配制：

1. 3 %高锰酸钾溶液：将高锰酸钾3 g溶于水，稀释至100 ml，每星期配制一次。
 
2. 核黄素标准溶液（0.5 μg/ml）：取储备液（25 μg/ml）1 ml，稀释至50 ml，临用前配制。
 
3. 荧光红钠储备溶液（50 μg /ml）：50 mg荧光红钠溶于1000 ml水中。
 
4. 荧光红钠应用液（0.05 μg/ml）储备液稀释至1000 ml。

操作步骤：

1. 样品提取

（1）称取含有核黄素5～10 μg的均匀样品于125 ml锥形瓶中，加入50 ml 0.1 mol/L盐酸，置于高压下蒸煮30 min。

（2）将样品冷却，用氢氧化钠调至pH 6.0（因核黄素在碱性溶液中不稳定，滴加碱液时边加边摇，避免局部碱性过强），再迅速用1 mol/L盐酸调至pH 4.5，使杂质沉淀。

（3）用水稀释至100 ml，过滤。如样品量过大，可过滤后稀释，样品稀释度由所用标准液浓度来定。

2. 滤液酸化

（1）取两个试管（A），分别加入10 ml滤液和1 ml水。

（2）另取两个试管（B），分别加入10 ml滤液和1 ml核黄素标准液（0.5 μg/ml）。

（3）以上四个管各加1 ml冰醋酸。

3. 纯化
（1）每个试管各加入0.5 ml 3%高锰酸钾，混匀后放置2 min以充分氧化样品内的杂质。

（2）另取两个试管（C），分别加入10 ml滤液和1 ml水及1 ml冰醋酸，然后向两支试管中各加入20 mg硫代硫酸钠，使样品中的杂质与核黄素都还原成无荧光物质，再摇动，使核黄素与空气接触而被氧化，测其荧光。

（3）在A、B管内各加0.5 ml 3%双氧水（其不宜过量，以免产生气泡，影响荧光读数），混匀，10 s内褪去颜色。

4. 荧光测定

（1）用荧光红钠溶液调整指针，使之每次都在一定的读数上（如50～80）。

（2）滤液加水的荧光读数为A。

（3）滤液加标准液的荧光读数为B。

（4）滤液内加硫代硫酸钠的荧光读数为C。

5. 计算